【摘 要】
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马铃薯产业在我国保障粮食安全和增加农民收入方面有着重要的战略地位,但无性繁殖的马铃薯受到多种病毒的危害,严重影响块茎的产量和品质。培育抗病毒的品种是最为经济有效的方法,但是能够感染马铃薯的病毒种类繁多,而且马铃薯复杂的倍性导致常规育种进程缓慢。基于CRISPR的高效率基因编辑技术不仅成功应用于基因表达调控、染色体定位中,也被用于抵御多种作物的DNA和RNA。本研究基于病毒序列的保守性,设计了靶向几
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马铃薯产业在我国保障粮食安全和增加农民收入方面有着重要的战略地位,但无性繁殖的马铃薯受到多种病毒的危害,严重影响块茎的产量和品质。培育抗病毒的品种是最为经济有效的方法,但是能够感染马铃薯的病毒种类繁多,而且马铃薯复杂的倍性导致常规育种进程缓慢。基于CRISPR的高效率基因编辑技术不仅成功应用于基因表达调控、染色体定位中,也被用于抵御多种作物的DNA和RNA。本研究基于病毒序列的保守性,设计了靶向几种重要马铃薯病毒基因组的特异性gRNA,构建了能够完整表达Cas13a以及cr RNA的CRISPR/Cas13a载体,进一步利用马铃薯叶片转化技术在马铃薯Desiree中稳定表达,并鉴定了该技术改良马铃薯病毒抗性的效果。主要结果如下:1.设计了分别靶向PVX的TGBp1基因、PLRV的Rd Rp和CP基因、PSTVd的A区和B区的gRNA,构建了相应的CRISPR/Cas13a载体。通过马铃薯叶片转化,获得了马铃薯品种Desiree的34个阳性转基因株系,其中PVX-TGBp1株系20个、PLRV-Rd Rp株系和PLRV-CP株系各2个、PSTVd-A株系6个、PSTVd-B株系4个。2.对转基因株系中的Cas13a表达量进行测定,筛选出高表达的株系进行病毒抗性鉴定。根据ELISA和q RT-PCR的病毒检测结果,鉴定出PVY-P3#1、PVY-P3#3对PVY有着明显的抗性,PVX-TGBp1#5、PVX-TGBp1#25对PVX的抗性最为显著且持久,而PLRV-Rd Rp和PLRV-CP对PLRV没有明显的抗性,PSTVd-A和PSTVd-B的所有株系均对PSTVd表现出明显的抗性。3.对靶向PVX的转基因株系进行了进一步的分析,发现转基因株系中的Cas13a表达量越高,植物体内的病毒水平越低,CRISPR/Cas13a的抗病毒效果越好。同时发现,Cas13a表达量随着植株的生长发育进程有下降的趋势;对各株系中的PVX靶标序列进行克隆测序发现,CRISPR/Cas13a能够完全降解与其gRNA完全匹配的分子变种,而对于有单个碱基错配的分子变种仍然拥有一定的降解活性。
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