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第一部分：纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG的制备及性能检测
目的：制备纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG，检测其基本的理化学性质、酶催化能力和光动力和光热性能。
方法：采用氧化聚合反应制备Fe-PDAP载体，利用静电作用和π-π反应将葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOx)和吲哚菁绿(Indocyanine Green, ICG)装载于Fe-PDAP上制备Fe-PDAP/GOx/ICG。检测该纳米粒基本的理化性质，包括粒径、电位、形态结构、Fe价态、紫外吸收光谱和酶催化等性能。在激光辐照下(808 nm)，检测该纳米粒在不同激光功率和不同浓度条件下光热性能及对热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)的影响。使用DPBF检测不同条件下该纳米粒在细胞外产生活性氧(Reactive oxygen, ROS)的能力。使用荧光探针DCFH-DA检测该纳米粒在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞内光动力性能。
结果：透射电镜下观察到制备的Fe-PDAP载体为梭形结构，大小均一，分散度好。马尔文粒径仪检测平均粒径为38.9nm，平均电位为+36.5mV，X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)出现特异性Fe-N(N2)峰，证明了Fe-PDAP制备成功。
透射电镜下可观察Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒外层的ICG和GOx，粒径为63.9nm，平均电位为-23.33mV。紫外吸收光谱显示Fe-PDAP/GOx/ICG出现ICG特异性吸收峰，并测得ICG的包封率为90%。傅里叶红外光谱显示了GOx在1545和1612cm-1处有GOx的特征吸收峰，从而证实了GOx在Fe-PDAP上的成功装载，通过高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)测量的GOx的包封率约为80%。且粉末X射线衍射(powder X-ray diffraction,PXRD)显示Fe-PDAP和Fe-PDAP/GOx/ICG结构无差异，表明制备Fe-PDAP/GOx/ICG的过程对Fe-PDAP的结构无影响。Fe2p1/2和Fe2p3/2的典型结合能峰证明了纳米颗粒中铁的价态为三价，电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)测定Fe的含量为3.42wt％。
在加入Fe-PDAP/GOx/ICG后葡萄糖溶液的pH值下降，证明了Fe-PDAP/GOx/ICG能够催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和H2O2，且H2O2能够被Fe-PDAP/GOx/ICG催化产生氧气。而且Fe-PDAP/GOx/ICG能够清除肿瘤中的谷胱甘肽(glutathione, GSH)，使得纳米粒在激光辐照下活性氧产量提高。
Fe-PDAP/GOx/ICG在给予808nm激光辐照后升温效果明显，与激光功率和纳米粒的浓度相关，且Fe-PDAP/GOx/ICG可以使三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和HSPs的表达明显下降。
结论：成功地制备了Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒。该纳米粒大小均匀，分散性好，具有良好的酶催化能力，光动力效果和光热效果，为乳腺癌成像和治疗奠定了基础。
第二部分：纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG体内外磁共振成像研究
目的：研究Fe-PDAP/GOx/ICG在体外及裸鼠乳腺癌移植瘤内的磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)的效果。
方法：将Fe-PDAP/GOx/ICG根据Fe浓度稀释为0.02、0.04、0.083、0.167、0.33mM，MRI扫描后获得T1加权和T1-mapping磁共振图像，测量信号强度值并计算T1弛豫系数。
随后建立裸鼠MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型，尾静脉注射Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒，并在注射后0、1、3、6、12和48小时后采集磁共振图像。然后通过MR成像系统中的软件对每个图像中的感兴趣区域(Region of interest，ROI)进行定量分析。
结果：在体外磁共振成像中，Fe-PDAP/GOx/ICG可明显增强磁共振成像，且T1加权MR图像显示出明显的Fe浓度依赖性，且呈良好的线性相关，根据线性回归分析的斜率，Fe-PDAP/GOx/ICG的T1弛豫系数(r1)值为2.122mM-1S-1。
在乳腺癌移植瘤体内成像实验中，Fe-PDAP/GOx/ICG在肿瘤区域部位逐渐富集，在给药1小时后可见磁共振成像，在给药3小时后达到最高峰，并可持续到12小时。
结论：制备的Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒能够增强体内外磁共振成像，是一种有潜力的磁共振显影剂。
第三部分：纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG对乳腺癌的治疗及机制研究
目的：研究Fe-PDAP/GOx/IC体内外的光热治疗(Photothermal therapy, PTT)，光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)及联合治疗乳腺癌的效果其机制。评估Fe-PDAP/GOx/ICG的生物安全性。
方法：将乳腺癌MDA-MB-231细胞与不同浓度的Fe-PDAP、Fe-PDAP/ICG及Fe-PDAP/GOx/ICG共同孵育24小时，用CCK-8法检测细胞活性，并计算细胞存活率。将ICG、Fe-PDAP/ICG及Fe-PDAP/GOx/ICG与细胞孵育4小时，给予808nm激光辐照，使用CCK-8法及钙黄绿素(Calcein-AM, CAM)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染色法检测细胞的光毒性，比较不同纳米粒的PDT、PTT效果以及联合治疗效果。
建立MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型，把荷瘤裸鼠随机分成8组:(ⅰ)对照组(给予生理盐水)，(ⅱ)激光组，(ⅲ)ICG+PDT，(ⅳ)Fe-PDAP/ICG+PDT组，(ⅴ)Fe-PDAP/GOx/ICG组,(ⅵ)Fe-PDAP/GOx/ICG+PDT组,(ⅶ)Fe-PDAP/ICG+PDT+PTT组,(ⅷ)Fe-PDAP/GOx/ICG+PDT+PTT组。其中(ⅲ)，(ⅳ)和(ⅵ)组给予间断激光辐照，激光强度为1.0W/cm2,开30s然后关30s，共20个周期。(ⅱ)，(ⅶ)和(ⅷ)组给予连续激光辐照，激光强度为1.0W/cm2,作用时间10min，治疗过程中用热红外成像仪记录肿瘤区域的升温情况。治疗期间每隔1天称量体重、测量肿瘤体积大小。不同组的裸鼠在治疗后2天，随机挑选一只裸鼠处死，收集主要的脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)和肿瘤组织，对组织予以苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H&E)染色。取出的肿瘤组织进行增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA和凋亡原位染色(TdT-mediateddUTPNick-End,TUNEL)免疫组化染色检测肿瘤细胞的增殖和凋亡情况。
为明确Fe-PDAP/GOx/ICG对肿瘤组织乏氧状态的影响，把荷瘤裸鼠随机分为对照组、Fe-PDAP/ICG组和Fe-PDAP/GOx/ICG组，在注射纳米粒24小时后收集肿瘤组织，免疫荧光法检测组织中低氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)的表达。
为研究Fe-PDAP/GOx/ICG对热休克蛋白表达的影响，把荷瘤裸鼠分为3组，分别为对照组、Fe-PDAP/ICG+激光组和Fe-PDAP/GOx/ICG+激光组，用免疫荧光法检测热休克蛋70(Heat Shock Protein70, HSP70)的表达。
为评估Fe-PDAP/GOx/ICG体内生物安全性，选取25只昆明鼠，并静脉给予Fe-PDAP/GOx/ICG，分别在给药前及给药1、7、14和28天后眼眶取血检测血常规及血生化的变化，并取主要器官进行H&E染色。
结果：Fe-PDAP和Fe-PDAP/ICG在较高浓度下对细胞活性无明显影响，证明了这两种材料的安全性。当将细胞与Fe-PDAP/GOx/ICG或GOx一起孵育时，其细胞毒性随着浓度升高而升高。体外的PDT结果证明，在同等浓度下Fe-PDAP/ICG比游离ICG显示出更高的光动力治疗效果，这表明Fe-PDAP有助于提高PDT的治疗效率。
CCK-8结果显示ICG+PTT组的细胞死亡约为61％，Fe-PADP/ICG+PTT治疗组的细胞死亡约为66％，而Fe-PADP/GOx/ICG+PTT治疗组则为75％。而CCK-8法和Calcein-AM/PI双染法也证明了Fe-PADP/GOx/ICG+PDT+PTT组乳腺癌细胞都几乎都被杀死了，显示出最佳的治疗效果。
体内治疗结果显示，(ⅰ)对照组(给予生理盐水)、(ⅱ)激光组和(ⅲ)ICG+激光组对肿瘤生长无明显抑制作用，而(ⅳ)Fe-PADP/ICG组对裸鼠的生长有一定的抑制作用。(ⅴ)组的小鼠在没有激光辐照的情况下表现出一定的抗肿瘤活性，这归因于Fe-PDAP/GOx/ICG在肿瘤的蓄积和饥饿的治疗作用。(ⅶ)Fe-PDAP/ICG+PDT+PTT组裸鼠在治疗后出现了肿瘤的复发，而(ⅷ)Fe-PDAP/GOx/ICG+PDT+PTT组完全抑制了裸鼠的肿瘤生长，且没有复发。随后的病理组织切片也证实了该结果，与其他组相比，(ⅷ)Fe-PADP/GOX/ICG+PDT+PTT显示出明显的核变形和细胞凋亡，而细胞增殖较少，这与体内治疗结果一致。此外，在所有治疗组中均未观察到主要器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和脑)的病理变化。
肿瘤组织的HIF-1α的免疫荧光结果显示，与对照组相比，在给予Fe-PADP/ICG和Fe-PADP/GOX/ICG后肿瘤组织的HIF-1α的表达明显降低，证明Fe-PADP可以改善肿瘤部位的乏氧状态。
HSP70免疫荧光显示Fe-PADP/GOx/ICG+激光组的HSP70表达较Fe-PADP/ICG加激光组低，表明GOx介导的饥饿治疗可以一定程度上降低HSP的表达，从而增强光热治疗效果。
且给予Fe-PADP/GOX/ICG后，不同时间点的血液指标及H&E与对照组无明显区别，证明了该纳米粒的生物安全性。
结论：制备的Fe-PADP/GOX/ICG可以有效缓解肿瘤组织的乏氧状态，增效光动力治疗效果。同时可以减少HSP70的表达，从而增强光热治疗效果。Fe-PADP/GOX/ICG增效的光热及光动力协同治疗可以完全抑制乳腺癌的生长。
目的：制备纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG，检测其基本的理化学性质、酶催化能力和光动力和光热性能。
方法：采用氧化聚合反应制备Fe-PDAP载体，利用静电作用和π-π反应将葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOx)和吲哚菁绿(Indocyanine Green, ICG)装载于Fe-PDAP上制备Fe-PDAP/GOx/ICG。检测该纳米粒基本的理化性质，包括粒径、电位、形态结构、Fe价态、紫外吸收光谱和酶催化等性能。在激光辐照下(808 nm)，检测该纳米粒在不同激光功率和不同浓度条件下光热性能及对热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)的影响。使用DPBF检测不同条件下该纳米粒在细胞外产生活性氧(Reactive oxygen, ROS)的能力。使用荧光探针DCFH-DA检测该纳米粒在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞内光动力性能。
结果：透射电镜下观察到制备的Fe-PDAP载体为梭形结构，大小均一，分散度好。马尔文粒径仪检测平均粒径为38.9nm，平均电位为+36.5mV，X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)出现特异性Fe-N(N2)峰，证明了Fe-PDAP制备成功。
透射电镜下可观察Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒外层的ICG和GOx，粒径为63.9nm，平均电位为-23.33mV。紫外吸收光谱显示Fe-PDAP/GOx/ICG出现ICG特异性吸收峰，并测得ICG的包封率为90%。傅里叶红外光谱显示了GOx在1545和1612cm-1处有GOx的特征吸收峰，从而证实了GOx在Fe-PDAP上的成功装载，通过高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)测量的GOx的包封率约为80%。且粉末X射线衍射(powder X-ray diffraction,PXRD)显示Fe-PDAP和Fe-PDAP/GOx/ICG结构无差异，表明制备Fe-PDAP/GOx/ICG的过程对Fe-PDAP的结构无影响。Fe2p1/2和Fe2p3/2的典型结合能峰证明了纳米颗粒中铁的价态为三价，电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)测定Fe的含量为3.42wt％。
在加入Fe-PDAP/GOx/ICG后葡萄糖溶液的pH值下降，证明了Fe-PDAP/GOx/ICG能够催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和H2O2，且H2O2能够被Fe-PDAP/GOx/ICG催化产生氧气。而且Fe-PDAP/GOx/ICG能够清除肿瘤中的谷胱甘肽(glutathione, GSH)，使得纳米粒在激光辐照下活性氧产量提高。
Fe-PDAP/GOx/ICG在给予808nm激光辐照后升温效果明显，与激光功率和纳米粒的浓度相关，且Fe-PDAP/GOx/ICG可以使三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和HSPs的表达明显下降。
结论：成功地制备了Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒。该纳米粒大小均匀，分散性好，具有良好的酶催化能力，光动力效果和光热效果，为乳腺癌成像和治疗奠定了基础。
第二部分：纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG体内外磁共振成像研究
目的：研究Fe-PDAP/GOx/ICG在体外及裸鼠乳腺癌移植瘤内的磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)的效果。
方法：将Fe-PDAP/GOx/ICG根据Fe浓度稀释为0.02、0.04、0.083、0.167、0.33mM，MRI扫描后获得T1加权和T1-mapping磁共振图像，测量信号强度值并计算T1弛豫系数。
随后建立裸鼠MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型，尾静脉注射Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒，并在注射后0、1、3、6、12和48小时后采集磁共振图像。然后通过MR成像系统中的软件对每个图像中的感兴趣区域(Region of interest，ROI)进行定量分析。
结果：在体外磁共振成像中，Fe-PDAP/GOx/ICG可明显增强磁共振成像，且T1加权MR图像显示出明显的Fe浓度依赖性，且呈良好的线性相关，根据线性回归分析的斜率，Fe-PDAP/GOx/ICG的T1弛豫系数(r1)值为2.122mM-1S-1。
在乳腺癌移植瘤体内成像实验中，Fe-PDAP/GOx/ICG在肿瘤区域部位逐渐富集，在给药1小时后可见磁共振成像，在给药3小时后达到最高峰，并可持续到12小时。
结论：制备的Fe-PDAP/GOx/ICG纳米粒能够增强体内外磁共振成像，是一种有潜力的磁共振显影剂。
第三部分：纳米酶Fe-PDAP/GOx/ICG对乳腺癌的治疗及机制研究
目的：研究Fe-PDAP/GOx/IC体内外的光热治疗(Photothermal therapy, PTT)，光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)及联合治疗乳腺癌的效果其机制。评估Fe-PDAP/GOx/ICG的生物安全性。
方法：将乳腺癌MDA-MB-231细胞与不同浓度的Fe-PDAP、Fe-PDAP/ICG及Fe-PDAP/GOx/ICG共同孵育24小时，用CCK-8法检测细胞活性，并计算细胞存活率。将ICG、Fe-PDAP/ICG及Fe-PDAP/GOx/ICG与细胞孵育4小时，给予808nm激光辐照，使用CCK-8法及钙黄绿素(Calcein-AM, CAM)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染色法检测细胞的光毒性，比较不同纳米粒的PDT、PTT效果以及联合治疗效果。
建立MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型，把荷瘤裸鼠随机分成8组:(ⅰ)对照组(给予生理盐水)，(ⅱ)激光组，(ⅲ)ICG+PDT，(ⅳ)Fe-PDAP/ICG+PDT组，(ⅴ)Fe-PDAP/GOx/ICG组,(ⅵ)Fe-PDAP/GOx/ICG+PDT组,(ⅶ)Fe-PDAP/ICG+PDT+PTT组,(ⅷ)Fe-PDAP/GOx/ICG+PDT+PTT组。其中(ⅲ)，(ⅳ)和(ⅵ)组给予间断激光辐照，激光强度为1.0W/cm2,开30s然后关30s，共20个周期。(ⅱ)，(ⅶ)和(ⅷ)组给予连续激光辐照，激光强度为1.0W/cm2,作用时间10min，治疗过程中用热红外成像仪记录肿瘤区域的升温情况。治疗期间每隔1天称量体重、测量肿瘤体积大小。不同组的裸鼠在治疗后2天，随机挑选一只裸鼠处死，收集主要的脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)和肿瘤组织，对组织予以苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H&E)染色。取出的肿瘤组织进行增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA和凋亡原位染色(TdT-mediateddUTPNick-End,TUNEL)免疫组化染色检测肿瘤细胞的增殖和凋亡情况。
为明确Fe-PDAP/GOx/ICG对肿瘤组织乏氧状态的影响，把荷瘤裸鼠随机分为对照组、Fe-PDAP/ICG组和Fe-PDAP/GOx/ICG组，在注射纳米粒24小时后收集肿瘤组织，免疫荧光法检测组织中低氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)的表达。
为研究Fe-PDAP/GOx/ICG对热休克蛋白表达的影响，把荷瘤裸鼠分为3组，分别为对照组、Fe-PDAP/ICG+激光组和Fe-PDAP/GOx/ICG+激光组，用免疫荧光法检测热休克蛋70(Heat Shock Protein70, HSP70)的表达。
为评估Fe-PDAP/GOx/ICG体内生物安全性，选取25只昆明鼠，并静脉给予Fe-PDAP/GOx/ICG，分别在给药前及给药1、7、14和28天后眼眶取血检测血常规及血生化的变化，并取主要器官进行H&E染色。
结果：Fe-PDAP和Fe-PDAP/ICG在较高浓度下对细胞活性无明显影响，证明了这两种材料的安全性。当将细胞与Fe-PDAP/GOx/ICG或GOx一起孵育时，其细胞毒性随着浓度升高而升高。体外的PDT结果证明，在同等浓度下Fe-PDAP/ICG比游离ICG显示出更高的光动力治疗效果，这表明Fe-PDAP有助于提高PDT的治疗效率。
CCK-8结果显示ICG+PTT组的细胞死亡约为61％，Fe-PADP/ICG+PTT治疗组的细胞死亡约为66％，而Fe-PADP/GOx/ICG+PTT治疗组则为75％。而CCK-8法和Calcein-AM/PI双染法也证明了Fe-PADP/GOx/ICG+PDT+PTT组乳腺癌细胞都几乎都被杀死了，显示出最佳的治疗效果。
体内治疗结果显示，(ⅰ)对照组(给予生理盐水)、(ⅱ)激光组和(ⅲ)ICG+激光组对肿瘤生长无明显抑制作用，而(ⅳ)Fe-PADP/ICG组对裸鼠的生长有一定的抑制作用。(ⅴ)组的小鼠在没有激光辐照的情况下表现出一定的抗肿瘤活性，这归因于Fe-PDAP/GOx/ICG在肿瘤的蓄积和饥饿的治疗作用。(ⅶ)Fe-PDAP/ICG+PDT+PTT组裸鼠在治疗后出现了肿瘤的复发，而(ⅷ)Fe-PDAP/GOx/ICG+PDT+PTT组完全抑制了裸鼠的肿瘤生长，且没有复发。随后的病理组织切片也证实了该结果，与其他组相比，(ⅷ)Fe-PADP/GOX/ICG+PDT+PTT显示出明显的核变形和细胞凋亡，而细胞增殖较少，这与体内治疗结果一致。此外，在所有治疗组中均未观察到主要器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和脑)的病理变化。
肿瘤组织的HIF-1α的免疫荧光结果显示，与对照组相比，在给予Fe-PADP/ICG和Fe-PADP/GOX/ICG后肿瘤组织的HIF-1α的表达明显降低，证明Fe-PADP可以改善肿瘤部位的乏氧状态。
HSP70免疫荧光显示Fe-PADP/GOx/ICG+激光组的HSP70表达较Fe-PADP/ICG加激光组低，表明GOx介导的饥饿治疗可以一定程度上降低HSP的表达，从而增强光热治疗效果。
且给予Fe-PADP/GOX/ICG后，不同时间点的血液指标及H&E与对照组无明显区别，证明了该纳米粒的生物安全性。
结论：制备的Fe-PADP/GOX/ICG可以有效缓解肿瘤组织的乏氧状态，增效光动力治疗效果。同时可以减少HSP70的表达，从而增强光热治疗效果。Fe-PADP/GOX/ICG增效的光热及光动力协同治疗可以完全抑制乳腺癌的生长。