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SET(suppressor of variegation,enhancer of zeste and trithora)家族蛋白是在14年前由Stephen等人首次发现的,该家族成员的共同特征之一是含有一个高度保守的SET结构域[1]。SET结构域最初是在果蝇Suppressor of variegation(Su(var)3-9),Enhancer of zeste(E(z)),以及Trithorax这三个调节因子的羧基末端(carboxyl terminal)发现的共同基序,由约130个氨基酸(amino acid)组成,是植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶中大亚基甲基转移酶(large subunit methyltransferase,LSMTs)的一部分[2]。SET结构域中的SET-N、SET-C两段高度保守,羧基端含有大量与活性相关的氨基酸残基,位于该结构域中间的SETD-I可以特异性识别甲基转移酶的底物及辅助因子。而对部分含SET结构域的蛋白的生物学功能的研究结果进一步提示了它们在细胞的生命活动中扮演着极为重要的角色。越来越多的证据表明,SET家族蛋白具有组蛋白及非组蛋白甲基化转移酶的功能,能够调控基因表达,参与基因转录抑制及异染色体沉寂,影响个体发育和细胞生长周期。因此,一旦SET家族蛋白的表达失调,将引起非正常的细胞转化、增生,甚至导致肿瘤的发生。可见,SET家族蛋白在炎症反应的进程以及肿瘤的发生发展中具有极其重要的作用,也因此成为了研究热点。SETD4是SET家族的成员之一,同样具有高度保守的SET结构域。SET结构域在真核生物中发挥了重要的生物学作用,具有催化活性,据此推测,SETD4可能具有组蛋白或非组蛋白甲基化转移酶的功能,能够调控基因表达,参与基因转录抑制及异染色体沉寂,影响个体发育和细胞生长周期。虽然人们己经发现高等真核细胞中存在多种SET家族蛋白,但现在己被实验研究证实其功能的仅占其中极小的一部分,目前我们所要面临的最大挑战之一便是如何通过实验来证明这些蛋白的作用并且揭示出这些蛋白参与的生物学功能。目前关于SETD4蛋白的功能研究相关报道还比较少,作为SET家族的一员,SETD4蛋白很可能具有组蛋白及非组蛋白甲基化转移酶的功能,其在细胞中的功能改变将导致机体某些功能异常,从而导致某些疾病的发生发展。近期文献报道下调SETD4的表达能抑制人类乳腺癌细胞株的增殖。细胞凋亡和细胞增殖是生物体的重要生命特征,不少SET家族成员与细胞凋亡或细胞增殖密切相关,一旦SET家族蛋白的表达失调,将引起非正常的细胞转化、增生,引起机体各系统的功能的紊乱,导致多种疾病甚至肿瘤的的发生。因此,深入探讨甲基化转移酶及其甲基化作用在细胞增殖和凋亡中的作用,对于阐明相关疾病的发生机制具有重要的作用。另外,在本实验室的前期研究工作中表明在细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症因子的基因特性调控过程中会有SETD4蛋白的参与,但是,SETD4蛋白参与此过程的作用机制尚不清楚。而LPS诱导的炎症反应主要是由TLR4及其介导信号通路所介导,那么SETD4对细胞因子释放的调控作用是否具有特异性我们并不知道。因此,还需要探讨该蛋白在炎性细胞巨噬细胞在受到其他微生物产物刺激时对炎症因子释放的影响,从而为其作用机制的进一步分析奠定基础。针对上述科学问题,本实验分为以下部分:第一部分:探讨SETD4在炎症反应中的作用。我们先检测了细菌脂蛋白(bacterial lipoprotein,BLP)或多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyinosinicacid-polycytidylic acid,Poly(I:C))刺激 RAW264.7 细胞 0h、0.5h、1h、2h、6 h后SETD4的变化情况探讨在不同SETD4表达水平的前提下对细胞增殖和凋亡的影响。另外,我们还检测了 SETD4对下游炎症因子释放的作用。合成有效的特异性setd4干扰片段,通过siRNA技术下调RAW264.7细胞中SETD4的表达,利用液相蛋白芯片技术检测BLP或Poly(I:C)刺激12 h、24 h后细胞上清中细胞因子的释放。第二部分:探讨SETD4在细胞增殖及凋亡中的作用。我们以己知的小鼠setd4基因序列为基础,构建真核表达的质粒,并合成有效的setd4干扰片段,从而上调或下调细胞中SETD4的表达,然后用MTT实验来检测过表达SETD4蛋白及低表达SETD4蛋白对细胞存活的影响,并进一步用流式细胞术检测过表达SETD4蛋白及低表达SETD4蛋白是否会通过细胞凋亡途径影响细胞状态。综上所述,本论文已取得的实验结果如下:1.BLP 刺激 RAW264.7 细胞 6 h 后 SETD4 mRNA 水平明显上升;Poly(I:C)刺激RAW264.7细胞1 h后SETD4 mRNA先出现下降,随后恢复正常,刺激6 h后SETD4 mRNA水平明显上升,改变具有统计学差异(P<0.05);2.siRNA干扰技术下调RAW264.7细胞中SETD4蛋白的表达后,如果用TLR2激动剂BLP刺激细胞,细胞培养上清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的释放减少;如果用Poly(I:C)刺激细胞,细胞培养上清中TNF-α释放增多;3.3T3细胞过表达SETD4蛋白24h、48h后,MTT结果显示各组间细胞增殖与活力的差异不具有统计学意义(P>0.05),流式细胞术结果显示各组间细胞的凋亡的差异不具有统计学意义(P>0.05);siRNA干扰下调3T3细胞中SETD4蛋白后,MTT结果显示各组间细胞增殖与活力的差异不具有统计学意义(P>0.05),流式细胞术结果显示各组间细胞的凋亡的差异不具有统计学意义(P>0.05);下调RAW264.7细胞中SETD4蛋白的表达,MTT结果显示各组间细胞增殖与活力的差异不具有统计学意义(P>0.05)。根据上述实验结果,可得到以下初步结论:1.不同TLR受体激动剂的刺激均会导致SETD4 mRNA水平的变化,说明SETD4蛋白可能参与了炎症反应的发生发展过程。2.下调SETD4蛋白的表达后会影响巨噬细胞对炎性细胞因子的释放,这进一步说明SETD4蛋白参与了炎症反应的过程;SETD4蛋白下调后巨噬细胞对细胞因子释放的趋势不同提示SETD4蛋白对炎症因子的调控可能具有选择性。3.SETD4蛋白的过表达或低表达均不影响细胞增殖及细胞凋亡,说明SETD4蛋白可能不会直接参与细胞的增殖和凋亡过程。总之,SETD4蛋白的神秘面纱尚未揭开,其生物学功能尚有待进一步的探索。我们的研究初步发现SETD4蛋白并没有直接参与细胞的增殖和凋亡过程,但是在炎症反应特别是炎症因子的释放具有重要的调控作用。