【摘 要】
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目的:山药是一种多年生草本植物的块茎,富含淀粉、多糖、蛋白质等成分,在中国是一种常用的食材及药材。在山药的加工处理过程中,当新鲜山药汁液接触到人体皮肤时,山药汁液会引发人体产生明显的瘙痒。瘙痒是一种引发搔抓的不愉快的感觉,是皮肤原发性疾病和系统性疾病一种常见的临床症状。痒觉形成相关物质包括内源性和外源性致痒物,目前已发现多种内源性和外源性致痒物。山药中何种成分引发瘙痒尚不明确。本研究从新鲜山药中提
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目的:山药是一种多年生草本植物的块茎,富含淀粉、多糖、蛋白质等成分,在中国是一种常用的食材及药材。在山药的加工处理过程中,当新鲜山药汁液接触到人体皮肤时,山药汁液会引发人体产生明显的瘙痒。瘙痒是一种引发搔抓的不愉快的感觉,是皮肤原发性疾病和系统性疾病一种常见的临床症状。痒觉形成相关物质包括内源性和外源性致痒物,目前已发现多种内源性和外源性致痒物。山药中何种成分引发瘙痒尚不明确。本研究从新鲜山药中提取、分离纯化致痒活性成分,并分析致痒活性成分,为进一步探索山药致痒机制提供思路。研究方法:探索物理化学因素对山药致痒成分活性的影响,为分析山药中致痒活性成分的性质以及指导后续提取分离纯化条件提供参考依据。利用Q-HPR柱对山药蛋白粗提液进行分离纯化,得到不同的蛋白组分,并对各组分进行瘙痒评价及电生理检测。山药蛋白和山药蛋白分离后各组分通过液相色谱-质谱联用检测技术,进行蛋白质定性组学分析。使用Uni Prot-GOA数据库进行基因本体论(Gene Ontology,GO)注释分析;使用Inter Pro Scan软件以及Inter Pro结构域数据库对蛋白进行结构域注释及富集分析;使用STRING和Cytoscape软件进行蛋白-蛋白互作网络构建与模块化分析;使用Pfam数据库进行蛋白结构域的对比。统计学分析方面,使用SPSS 21和Graphpad 8.0进行数据分析及绘图,P<0.05被认为具有统计学意义,均为双侧检验。结果:新鲜山药具有致痒活性;低温对致痒成分的活性无影响,高温可使山药中的致痒成分活性减弱或丧失;pH为3或10时山药致痒成分失活;氧化对山药致痒成分的活性无影响;80%乙醇可使新鲜山药中的致痒成分失活。对山药蛋白进行分离纯化,获得4个组分,其中一个组分具有致痒活性。分离后组分对TRPA1离子通道有一定的激活作用。通过对山药总蛋白进行质谱分析,鉴定得到1529个蛋白质,蛋白注释显示其中有三个蛋白CATHB2,Os04g0650000和CCP2属于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶。GO富集分析显示生物学过程主要富集在柠檬酸盐代谢过程、三羧酸代谢过程、细胞质翻译、二磷酸核苷磷酸化和嘌呤核苷酸生物合成过程等;细胞组分主要富集在多聚核糖体、胞浆小核糖体亚单位、细胞连接和呼吸链复合体等;在分子功能主要富集在谷胱甘肽转移酶激活、药物结合、铜离子结合和氧化还原酶激活等。蛋白结构域富集到了磷酸葡萄糖异构酶、l类果糖二磷酸醛缩酶、二聚结构域、应激蛋白家族、III类转氨酶、木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶和Tu GTP结合域延伸因子等。对致痒组分进行质谱分析,鉴定到235个蛋白质,通过构建蛋白-蛋白互作网络分析,发现CCP2是连接两个独立网络的核心分子。在Pfam数据库中,CCP2注释到“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”,CCP2全长198个氨基酸,1-195氨基酸序列与“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”模型(模型全长218个氨基酸)的23-218序列相匹配。结论:1、山药蛋白中包含CCP2的组分可以引起皮肤瘙痒。2、CCP2属于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶,CCP2可能是山药中引起皮肤瘙痒的活性成分。
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