研究背景和目的随着社会的发展和人们生活水平的提高,人们生活方式、饮食结构、环境因素等的改变,使得糖尿病(diabetes mellitus, DM)、肥胖等代谢性疾病迅速发展,已成为全球最突出的社会问题。2012年中国糖尿病协会最新调查发现,中国糖尿病发病率高达9.7%,全国糖尿病患者达到1个亿,DM及其慢性并发症对人类健康产生极大的危害,给社会和家庭带来沉重的负担。DM是以人体内胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶细胞对胰岛素敏感性降低为特征,以及由此继发的以脂肪、蛋白质、水、电解质等全身代谢紊乱的一组综合征。DM可导致失明、肾功能衰竭、神经病变、心血管病变等多种并发症,降低生活质量、威胁健康和生命。DM分为1型糖尿病(Type1diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病type2diabetes mellitus,T2DM),分别占所有病历中的5-10%和90%。WHO对DM的诊断是：空腹血浆血糖7.0mmol/L或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)2小时血浆至11.1mmol/L。除了确诊的DM外,还有两种血糖异常的症状,即空腹血糖受损(Impaired Fasting Glucose,IFG)和糖耐量异常(Impaired Glucose Tolerance,IGT)。IFG的诊断标准为空腹血糖在6.1-6.9mmol/L之间,OGTT<7.8mmol/L; IGT为空腹血糖<7.0mmol/L.,OGTT>7.8mmol/L且<11.1mmol/L。这两种情况也称为糖尿病前期状态(Pre-diabetes mellitus, Pre-DM),是DM发生的前期症状,如若能在这一阶段及时控制血糖,阻断向DM的发展,对患者及家庭乃至整个社会意义重大。近年来研究发现T2DM的发生以胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对不足或以胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗为基本特征。胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)以慢性系统性低水平炎症反应为特征,促炎因子和氧化应激在的IR的过程中发挥重要作用。流行病学研究显示,人群中约有2.5%个体患有IR,而T2DM患者中IR患病率超过80%。IR与胰岛细胞、骨骼肌、脂肪组织、肝脏、肠道、下丘脑和免疫系统等多个组织器官相关,主要发生在外周组织(肌肉、脂肪)和肝脏,在前者可表现为胰岛素促进骨骼肌、脂肪组织摄取葡萄糖并加以利用或储存的功能减弱,在后者则表现为胰岛素抑制肝糖原输出能力减弱。研究表明,脂肪组织可能是系统炎症激活的中心位点：脂肪细胞可产生肿瘤坏死因子a(TNF-a),导致IR；高脂饮食和肥胖可诱导脂肪组织炎症发生,且伴有白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞核因子KB(NF-KB)、激动蛋白-1(AP1)和生长反应因子等炎症调节因子生成增加。研究表明肠道菌群与宿主的消化、营养、代谢、免疫等方面密切相关,是进入人体的“环境”因素,其地位与作用相当于后天获得的一个重要“器官”。近年来对肠道菌群的研究发现,肠道菌群不仅能够通过从饮食中增加额外的能量获取参与肥胖的发病,还能通过内毒素血症、调节组织生物活性脂肪酸构成、调节肠源性肽的分泌参与肥胖、DM等代谢性疾病的发生发展。T2DM患者的慢性炎症反应是由代谢性内毒素血症引起的一种低水平的炎症反应状态,而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为内毒素的主要成分,是肠道菌群革兰氏阴性细菌(G-)细胞壁的组成成分。LPS能够通过与免疫细胞CD14表面的T样受体4(TLR-4)结合形成复合物而激活免疫细胞,触发肥胖和IR的炎症反应状态。TLR-4代谢旁路在代谢性疾病中的作用在敲除TLR-4的告知饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠体内得到进一步证实。有关高脂饮食诱导肥胖小鼠一系列研究发现,高脂饮食能够引起小鼠双歧杆菌、真杆菌数量减少。肠道菌群构成改变引起的慢性代谢性内毒素血症能够引起肥胖、DM、IR的发生：1)高脂食物诱导肥胖的同时增加血液内毒素(LPS)的含量,能够使小鼠血液里的LPS升高2-3倍,达到代谢性内毒素血症的状态,且一直保持在一个较高的浓度；2)连续皮下灌输低剂量的LPS一个月后,小鼠的体重增加与高脂食物饲喂4周引起的肥胖相当；3)代谢性内毒素血症引起肝脏、内脏脂肪组织、皮下脂肪组织、肌肉IL-1、IL6、IL-8、TNF-a促炎症因子产生,类似高脂饮食诱导的系统性炎症反应；4)敲除CD14受体基因的小鼠在进食高脂食物4周后,糖耐量、胰岛素敏感性等指标依然正常,而野生型对照却出现了IR。表明LPS需要与CD14免疫细胞表面的TLR-4受体结合才能诱发炎症反应,耗尽TLR-4或是敲除TLR-4受体基因阻止了高脂食物诱导的IR,进一步证实了肠道菌群通过TLR-4通路与肥胖和T2DM等代谢性疾病的关系。关于LPS能够诱发系统性炎症反应在人体中也得到证实。研究发现代谢性内毒素血症能够引起脂肪组织TNF-a和IL-6浓度升高、IR,而且高脂饮食、高碳水化合物隐私能够显著升高餐后血浆LPS含量,同时伴随着免疫细胞TLR-4、 NF-KB的高表达,与IR相关的细胞因子通路SOCS-3表达抑制。但是在采用美国心脏协会富含纤维素和水果的饮食后,这些改变完全消失。这些研究均表明,内毒素血症伴在肥胖相关的炎症反应中发挥重要作用。由于肥胖是T2DM发病的一个重要危险因素,人们推测T2DM与肠道菌群可能也存在一定的关系。随着研究的逐步深入,人们发现T2DM患者或动物模型与正常对照者相比肠道菌群构成发生了改变,也有动物实验发现,通过改变饮食因素如增加糖分、脂肪的摄入来调节肠道菌群结构能够引起肥胖,进而增加DM的风险。肠道菌群与代谢性疾病的发生发展密切相关,已成为国内外研究的新热点。随着研究的逐步深入,人们发现T2DM和肥胖以胰岛素抵抗和低水平炎症反应为特征,而肠道菌群与宿主间在调节能量平衡、炎症反应方面存在着密切联系。因此人们推测肠道菌群和肥胖、T2DM等代谢性疾病的发生发展密切相关。基于以上研究背景,本研究选取T2DM患者、Pre-DM状态人群与健康志愿者作为研究对象,比较三组肠道菌群的差异,分析肠道菌群与空腹血糖、脂代谢之间的关系,探究肠道细菌在T2DM的发生、发展中可能存在的作用。方法根据1999年WHO的诊断标准纳入55名T2DM患者、46名健康志愿者、10名Pre-DM患者,对其粪便提取基因组DNA,应用菌属16srRNA v3序列特异性引物,进行实时荧光定量PCR分析,比较三组人群中各目标菌属含量及比例的差异。结果1、肠道菌群比较(1)三组人群细菌数量上的比较：三组肠道细菌总量存在显著差异,Pre-DM组显著高于其他两组(P=0.000)；三组人群中Pre-DM患者球形梭菌类群、普氏菌属、乳酸杆菌属含量虽高于其他两组,但是差异不显著(P值分别为0.179、0.186和0.239),而大肠杆菌属在Pre-DM组中的含量则显著高于其他两组(P=0.002); T2DM组柔嫩梭菌类群、双歧杆菌属、肠球菌属显著高于Pre-DM组和健康对照组(P值分别为0.011、0.012、0.000),拟杆菌属DM组和Pre-DM组显著低于健康对照组(P=0.006)。(2)三组人群之间各目的菌属占总细菌比例：健康对照组拟杆菌／球形梭菌显著高于T2DM患者和Pre-DM患者(p=0.000)。T2DM患者柔嫩梭菌类群%、双歧杆菌属%、肠球菌属%均明显高于对照组和Pre-DM组,差异具有统计学意义(P值分别为0.000、0.001和0.015)。Pre-DM患者大肠杆菌属%和普氏菌属%高于健康对照组和T2DM组,其中Pre-DM组大肠杆菌属%显著高于其他两组(P=0.015),而普氏菌属%在三组中的差异不显著。乳酸杆菌属%在三者之间差异极小2、肠道菌群与空腹血糖相关关系：拟杆菌属(R=-0.251P=0.008)、拟杆菌属/球形梭菌类群(R=-0.206P=0.030)与空腹血糖存在着显著负相关关系。肠球菌属(R=0.221P=0.020)、肠球菌属%(R=0.187P=0.050)与空腹血糖之间存在着显著正相关关系。而其他菌属与空腹血糖相关关系不显著。3、肠道菌群与脂代谢水平相关关系：肠球菌属(R=0.227P=0.016)、肠球菌属%(R=0.313P=0.001)与甘油三酯水平存在显著正相关关系。肠球菌属%(R=-0.228P=0.018)、柔嫩梭菌类群%(R=-0.248P=0.010)与高密度脂蛋水平存在显著负相关关系。肠道菌群与胆固醇、低密度脂蛋白水平相关关系不显著。结论1、T2DM患者及其前期状态人群中肠道内存在菌群失调2、肠道菌群与血糖代谢之间存在一定的关联3、肠道菌群与脂代谢之间存在一定的关联