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厌氧发酵制氢技术是近几年科学家们关注较多的生物制氢技术,利用此技术将处理高浓度有机废水与产氢有效结合,逐步研发了产氢效率较高,运行稳定,并能适用于工业化生产的厌氧发酵制氢反应器。开展厌氧发酵制氢反应器与产氢细菌蛋白质组学研究为进一步提高厌氧发酵制氢反应器的产氢效率提供重要信息和技术支持。本研究通过连续流搅拌槽式反应器（CSTR）的连续运行处理高浓度糖蜜废水,通过对工程参数的控制维持反应器的稳定运行,并对活性污泥进行驯化。采用Illumina MiSeq平台高通量测序技术对比分析了启动运行不同阶段的优势菌群组成,筛选到高效产氢菌株,进而采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术,分析了该菌株在产氢过程中的丰度差异蛋白质。结果表明,不同起始污泥负荷的两次CSTR的启动运行均较好地完成了活性污泥的驯化。两次CSTR反应器运行的出水p H值均稳定在4.74.9,经过驯化后的活性污泥具有良好的沉降性能。两次反应器运行的液相发酵产物总量分别为1,298mg?L-1和1,934 mg?L-1,其中乙酸和丁酸质量浓度占发酵产物总质量的73.1%和70.8%,因此两次CSTR反应器启动运行均为丁酸型发酵。活性污泥优势菌群分析表明,两次CSTR反应器的启动运行通过对活性污泥的驯化分别形成了以产乙醇杆菌属（Ethanoligenes）、巨球型菌属（Megasphaera）和Ⅳ型梭菌（ClostridiumⅣ）为主的优势菌群组成和以巨球型菌属（Megasphaera）、产乙醇杆菌属（Ethanoligenens）为主的优势菌群组成。经过两次CSTR反应器启动运行对活性污泥的驯化,与产氢功能相关的菌种均占污泥中微生物总量的40%以上。这表明CSTR反应器较好的完成了两次启动运行,并达到污泥驯化的目的,通过分离筛和获得目标菌种。对驯化后的活性污泥进行分离筛选,初步筛选出产氢能力较高菌种共8株,进一步进行间歇产氢实验,菌株WJY-29产氢能力最高,累计产气量和累计产氢量,分别为3,464mL/L-culture和2,004 m L/L-culture,16SrDNA分析表明,菌株WJY-29与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NRRL B-598）基因序列同源性达99%。选取pH为6.5的培养基条件,培养时间分别为10h、15h和30h的拜氏梭菌进行了基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学分析。经过三次生物学重复鉴定到757种可信差异蛋白质,其中378种蛋白质丰度上升,339种蛋白质丰度下降。糖酵解过程中的6-磷酸葡萄糖异构酶、烯醇化酶（磷酸丙酮酸水合酶）、醛脱氢酶,以及果糖二磷酸醛缩酶在拜氏梭菌WJY-29不同培养时间下蛋白质丰度明显上升。这表明拜氏梭菌WJY-29通过糖酵解途径分解葡萄糖。此外,铁氧还蛋白[FeFe]-氢化酶、甲酸脱氢酶、丙酮酸黄素氧化还原酶在拜氏梭菌WJY-29不同培养时间下蛋白质丰度上升显著。由此可推断拜氏梭菌WJY-29的产氢途径为,在严格厌氧的培养基中,拜氏梭菌WJY-29酵解葡萄糖,将葡萄糖分解成丙酮酸,在丙酮酸脱氢酶的作用下丙酮酸脱羧,羟乙基与酶的焦磷酸硫胺素结合,然后生成乙酰辅酶A,乙酰辅酶A进一步脱氢,还原铁氧还蛋白,进而在氢化酶的作用下,铁氧还蛋白被铁氧还蛋白氢化酶重新氧化并释放出H2。