【摘 要】
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目的:长非编码RNA（lncRNA）DLGAP1-AS2近来被认为是多种肿瘤的致癌因子。然而,其在胃癌中的生物学作用和临床意义却鲜为人知。在本研究中,我们对来自TCGA和GEO数据库的数据以及临床胃癌组织及血浆样本中DLGAP1-AS2的表达进行系统的分析。讨论DLGAP1-AS2表达与临床病理参数可能的关系。观察敲减DLGAP1-AS2对胃癌细胞表型影响,并研究具体的作用机制,探索DLGAP1-
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目的:长非编码RNA（lncRNA）DLGAP1-AS2近来被认为是多种肿瘤的致癌因子。然而,其在胃癌中的生物学作用和临床意义却鲜为人知。在本研究中,我们对来自TCGA和GEO数据库的数据以及临床胃癌组织及血浆样本中DLGAP1-AS2的表达进行系统的分析。讨论DLGAP1-AS2表达与临床病理参数可能的关系。观察敲减DLGAP1-AS2对胃癌细胞表型影响,并研究具体的作用机制,探索DLGAP1-AS2作为胃癌的诊断标记物和治疗靶点的潜力。方法:1、结合TCGA、GEO等生物信息学数据库源,分析胃癌相关数据中差异表达的lncRNA,挑出lncRNA DLGAP1-AS2。2、DLGAP1-AS2的水平通过q RT-PCR测定;卡方检验分析DLGAP1-AS2表达量与临床病理特征的关联;DLGAP1-AS2表达量与无进展生存期和总生存期的关系采用Kaplan-Meier法进行生存分析;DLGAP1-AS2的诊断价值通过构建ROC曲线评估。3、RNA干扰敲减DLGAP1-AS2,并对胃癌细胞表型进行分析。4、DLGAP1-AS2的下游靶标的筛选由分析DAVID数据库和q RT-PCR实验验证完成。5、q RT-PCR、Western blot、RIP及Chip实验结果验证DLGAP1-AS2和靶标基因间的作用关系。6、胃癌细胞谱生物学表型可由DLGAP1-AS2/Six3/Wnt通路改变。7、DLGAP1-AS2通过Six3调控Wnt通路对裸鼠移植的胃癌细胞成瘤能力的影响。结果:1、胃癌组织及血浆中DLGAP1-AS2经q RT-PCR测定表达水平高;分析组织、血浆中DLGAP1-AS2表达模式与临床病理参数之间的相关性,提示与TNM分期和淋巴结转移具有明显相关性;标准化生存曲线分析揭示具有较高水平的DLGAP1-AS2的患者总体生存期缩短;DLGAP1-AS2在外周血中的AUC值为0.718,表明有诊断价值。2、DLGAP1-AS2下调后可诱导细胞凋亡并抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。3、核质分离实验及生物信息学分析显示DLGAP1-AS2主要分布在细胞核中;KEGG及GO分析表明DLGAP1-AS2可能通过调控转录因子的表达影响Wnt信号通路的激活;q RT-PCR及Western blot结果显示Wnt1是DLGAP1-AS2的靶基因并且DLGAP1-AS2可影响Wnt通路下游基因c-Myc、cyclin D1、Slug、MMP2、MMP9、E-Cadherin和N-Cadherin的表达,故DLGAP1-AS2可能通过Wnt通路调控胃癌发展。4、RIP实验结果显示DLGAP1-AS2可与Six3结合,而Chip-q PCR实验表明后者可与Wnt1启动子区域相结合结合,表明DLGAP1-AS2可通过结合Six3调控Wnt通路发挥作用。5、Western blot成果证实,敲减DLGAP1-AS2后,Wnt1、磷酸化GSK-3β蛋白水平明显降低,β-catenin及其下游目标Myc、cyclin D1、Slug和N-cadherin蛋白水平均显著降低,同时伴有磷酸化β-catenin、GSK-3β以及E-cadherin上调。而DLGAP1-AS2敲减并Six3干扰后,可逆转上述现象,在此基础上进行Wnt1干扰或添加β-catenin/TCF4相互作用拮抗剂（LF3）,可抵消上述Six3干扰的影响。这些发现支持了Six3在DLGAP1-AS2介导Wnt/β-catenin信号转导中的关键作用。6、细胞功能缺失和增益实验说明DLGAP1-AS2敲减后胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力下降,但DLGAP1-AS2敲减并Six3干扰后,可逆转上述对胃癌细胞活力的抑制,在此基础上进行Wnt1干扰或添加LF3可再次致胃癌细胞增殖及移动活力下降。7、体内实验显示,DLGAP1-AS2敲减可明显削弱肿瘤的成长,而Six3干扰可促进瘤体的生成,在此基础上添加LF3可再次逆转其表征变化。结论:LncRNA DLGAP1-AS2作为一种致癌因子,通过与转录因子Six3直接结合,促进Wnt1表达,从而加速了胃癌的恶性转化。DLGAP1-AS2/Six3/Wnt1/β-catenin信号转导轴可能能够作为胃癌的潜在的诊断和治疗靶点。
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