低温是一个不利于植物生长和生产的非生物胁迫因素,小麦作为中国第二大的粮食作物,在中国北方地区冬季寒冷,对冬小麦越冬过程产生不利影响,所以,寒冷气候对冬小麦的影响问题是影响小麦产量的关键问题。对小麦抗寒相关基因的研究有利于提高小麦低温防御能力,可以为揭示小麦中抗低温基因表达调控机制和抗寒分子机制提供重要参考价值,有助于利用遗传转化技术改良作物品质。本研究对重结晶抑制蛋白IRI基因启动子及其构建的缺失片段的功能进行验证分析,主要研究结果如下:1.课题组前期获得的IRI基因序列,根据IRI基因家族中不同基因序列的存在的差异性,利用Primer引物设计软件设计IRI基因的特异扩增引物与内参引物,以c DNA为模板,使用经过检测的基因IRI4、IRI5、IRI6的特异性引物,进行实时荧光定量PCR实验,检测在冬小麦M808中IRI4、IRI5、IRI6基因在低温和茉莉酸甲酯处理下的表达活性。经检测发现,三个基因均在低温和茉莉酸甲酯处理下表达水平有提高,且不同基因在植物中的根、茎、叶组织中的表达水平各不同。2.课题组前期使用染色体步移的方法等到基因IRIp1,结合小麦叠连群数据库BLAST分析,最终扩增得到与IRIp1同源性较高的六条IRI基因序列,选取同源性较高的其中两条IRIp2、IRIp3。利用Plant CARE对启动子IRIp1、IRIp2、IRIp3进行顺式作用元件预测。预测结果显示启动子序列上存在MYB,MYC,G-box等相关冷响应元件MEJA应答元件,光响应元件,TATA-box和CAAT-box保守序列以及增强子等重要顺式作用元件。3.对启动子IRIp1、IRIp2、IRIp3构建八条长度不同的缺失片段GUS融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化烟草侵染实验,侵染后烟草植株低温和茉莉酸甲酯处理,结果表明对于低温和激素胁迫处理下的启动子活性各不相同,IRIp1启动子的缺失片段IRIp1-1-GUS,IRIp1-3-GUS,IRIp1-4-GUS的GUS表达活性均较强,且在低温条件下响应于茉莉酸甲酯的诱导,IRIp1-4-GUS的活性较弱;启动子IRIp2和启动子IRIp3的缺失片段在低温与茉莉酸甲酯处理下活性均不强,在低温条件下不响应于茉莉酸甲酯的诱导。4.为进一步验证启动子IRIp1的四个缺失片段在低温和茉莉酸甲酯处理下的启动子活性水平,将八条启动子缺失片段GUS融合表达载体转入拟南芥中,进行拟南芥遗传转化实验,对拟南芥T₂代阳性转基因苗进行GUS染色,观察其在低温和茉莉酸甲酯处理下GUS报告基因的表达活性,结果表明IRIp1的四个缺失片段在转基因拟南芥中的染色情况与瞬时表达实验中的染色结果一致。