肥胖指体内脂肪积累过多和(或)异常分布、体重增加,是由于环境和遗传因素的相互作用而导致的慢性代谢疾病。胰岛素抵抗(IR)是联系肥胖与糖脂代谢紊乱的中心环节,是肥胖导致相关并发症的重要病理机制,并且两者常合并存在,相互影响。中医指出肝郁气滞、脾虚失健是胰岛素抵抗肥胖的一个关键病机,而内热是促进其发展的一个主要病理因素。大柴胡汤出自《伤寒杂病论》,以疏肝、泻热为主要功效。本课题组结合胰岛素抵抗肥胖的病机,在大柴胡汤原方的基础上加用茯苓、白术等健脾助运的经典药物,增强了健脾益气之功效,取名“加味大柴胡汤”。在前期的实验中我们也证实了具有疏肝健脾泻热功效的加味大柴胡汤不仅可有效降低体重和改善胰岛素抵抗,还有减轻氧化应激和炎症的作用。在现代医学研究方面发现,肥胖患者体内确实存在氧化应激过高和低度的慢性炎症。另外,线粒体是活性氧(ROS)产生的主要场所,却极易受到氧化损伤,而线粒体功能障碍又和胰岛素抵抗密切相关,同时线粒体自噬对于清除受损的线粒体恢复其功能至关重要。另外多项研究表明,长期高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖小鼠线粒体功能下降,线粒体自噬相关信号PINK1/Parkin在转录及翻译水平上均存在异常,而激活线粒体自噬则可有效缓解胰岛素抵抗肥胖。因此,为了进一步探讨加味大柴胡汤具体的作用机制,本课题首先建立肝郁脾虚胰岛素抵抗肥胖小鼠模型,然后拟用加味大柴胡汤进行治疗,观察加味大柴胡汤对胰岛素抵抗肥胖小鼠的作用,并从PINK1/Parkin信号通路进一步探讨其对胰岛素抵抗肥胖小鼠线粒体自噬与线粒体功能的影响。本实验首先用慢性束缚+夹尾激怒+过度疲劳+每日高脂饲料喂养的方法建立了肝郁脾虚胰岛素抵抗肥胖小鼠模型,然后造模成功后用加味大柴胡汤进行治疗,阳性药物选用二甲双胍。在灌胃给药期间监测小鼠一般状况、体重、血糖和血脂,并于实验最后一天进行高架十字迷宫实验并测定血清胃泌素和D-木糖含量了解其对肝郁脾虚的改善程度,实验结束后处死小鼠检测血清ACTH和CORT水平了解HPA轴的变化,并检测血清胰岛素水平和计算胰岛素抵抗指数反应胰岛素的敏感性。同时测量肾上腺、脾脏和胸腺指数,并取出肝脏,一部分用于HE染色观察病理改变,一部分做匀浆后用ELISA法检测抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性以及氧化应激产物MDA、8-OHd G和炎症因子IL-6、TNF-α等的水平,Real-time PCR和Western Blot检测PINK1/Parkin信号通路了解自噬相关蛋白的表达水平,最后提取肝细胞线粒体测量线粒体膜电位、线粒体肿胀度、ATP含量、三羧酸循环关键酶PDH和KGDH活性了解线粒体功能的改变。结果表明,用慢性束缚+夹尾激怒+过度疲劳+每日高脂饲料喂养8周能建立肝郁脾虚胰岛素抵抗肥胖小鼠模型,本模型所具有的特点主要如下:成模之后出现了显著的肝郁脾虚证症状;体重出现短期的降低之后显著升高,并保持稳定;血脂与激素方面的异常也与肥胖症较为相似;同时,还出现了免疫抑制和胰岛素抵抗;而且这种造模方式较为简单、便于操作。在进一步的药效学实验中发现,给予加味大柴胡汤对上述指标有一定的改善,表现在以下方面:小鼠的一般情况评分、血清胃泌素和D-木糖含量增加,而体重减轻;在高架十字迷宫实验中,小鼠的开放臂进入次数比例和开放臂停留时间比例增加;在血脂方面,TC和TG降低而HDL升高;在脏器指数方面,肾上腺指数降低而脾脏和胸腺指数增加;在激素指标方面,ACTH、CORT和胰岛素含量降低,同时胰岛素抵抗指数下降。在氧化应激和炎症介质方面,肝脏抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性增加而MDA、8OHd G、IL-6、TNF-α和CRP等氧化应激产物和炎症因子显著下降。同时PINK1/Parkin线粒体自噬信号通路相关蛋白的表达增加,线粒体功能得以恢复。综上所述,肝郁脾虚为胰岛素抵抗肥胖的重要病机,而“内热”在疾病的转变过程中起着助推作用,更是其重要的病理因素。作为体现疏肝健脾泻热治法的代表方加味大柴胡汤不仅可以减轻肝郁脾虚症状,降低体重和血脂,而且还能缓解HPA轴过度亢进和改善胰岛素抵抗,推测其机制可能是激活了PINK1/Parkin信号通路增强了线粒体自噬,从而缓解了肥胖状态下氧化应激对线粒体的损伤,恢复线粒体功能有关。