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目的SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phophatase-2),是由ptpn11基因编码的非受体酪氨酸磷酸酶,广泛存在于真核生物细胞中。SHP2在乳腺癌,白血病,肺癌,肝癌,胃癌,胰腺癌和口腔癌等都被证实有相关性,并且在多种肿瘤相关的生命过程中有参与,例如细胞侵袭,迁移,凋亡,DNA损伤,细胞增殖,细胞周期和耐药等。在多种肿瘤中都有证实癌细胞的增殖能力明显强于正常细胞,肿瘤细胞增殖能力异常是患者难以治愈和死亡率高的主要原因之一。SHP2是第一个被发现具有磷酸酶活性的癌基因,同时其磷酸酶活性对肿瘤的影响也是学术界关注的焦点之一。本研究的目的是,通过体外实验明确SHP2及其磷酸酶活性对乳腺癌细胞增殖的影响,初步探索其分子机制,从而为深入的机制研究和乳腺癌的治疗提供一些新的线索。方法1.通过细胞转染在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中构建SHP2瞬时和稳定降表达细胞系,在人乳腺癌细胞系BT549中构建SHP2瞬时降表达细胞系,通过Western blot验证降表达结果。2.通过细胞功能学实验CCK8,克隆形成实验和流式细胞技术明确下调SHP2表达后对乳腺癌细胞体外增殖能力的影响。3.通过Western blot明确下调SHP2的蛋白表达变化对细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1的蛋白表达水平的影响。4.通过实时荧光定量PCR明确下调SHP2的蛋白表达对细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1的m RNA水平的影响。5.通过Western blot明确细胞周期蛋白的半衰期和降解机制,并探索SHP2表达水平对细胞周期蛋白表达的影响机制。6.通过核苷酸点突变构建SHP2的突变体重组质粒。在已构建的SHP2稳定降表达细胞系中,通过慢病毒感染导入重组质粒,构建阴性对照组(sh SHP2-p CDH)、表达野生型SHP2组(sh SHP2-SHP2)、SHP2磷酸酶持续激活组(sh SHP2-N308D,sh SHP2-E76K)和SHP2磷酸酶持续失活组(sh SHP2-T468M)的稳定细胞系。7.通过体外细胞功能学实验CCK8,克隆形成实验和流式细胞技术明确SHP2磷酸酶活性对乳腺癌细胞体外增殖能力的影响。8.通过Western blot明确SHP2磷酸酶活性对细胞周期蛋白表达的影响。结果1.下调SHP2蛋白水平后,乳腺癌细胞中的增殖能力、克隆形成能力降低。2.下调SHP2蛋白表达后,乳腺癌细胞中的细胞周期中G2/M期的细胞比例增多。3.敲减SHP2蛋白水平,导致乳腺癌细胞中的细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1蛋白表达水平降低。4.下调SHP2蛋白水平,对乳腺癌细胞中的细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、m RNA水平没有显著影响。5.下调SHP2蛋白水平,乳腺癌细胞中的细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、蛋白水平的降低可能是通过泛素化-蛋白酶体机制降解的。6.SHP2磷酸酶激活会增强乳腺癌细胞的增殖能力,而SHP2磷酸酶失活会减弱乳腺癌细胞的增殖能力。7.SHP2磷酸酶激活可使细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1表达上调,SHP2磷酸酶失活可使其表达下调。结论本研究通过体外细胞学实验证实,SHP2可增强乳腺癌细胞的增殖能力,敲减SHP2会影响细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1的稳定性,可能通过泛素-蛋白酶体系统导致细胞周期蛋白表达下降。SHP2磷酸酶激活可通过上调细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1表达促进乳腺癌细胞增殖能力,SHP2磷酸酶失活可通过下调细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1表达抑制乳腺癌细胞增殖能力