糖原合成酶激酶(Glycogen synthesis kinanse3, GSK3)是一种多功能的丝/苏氨酸蛋白激酶,在哺乳动物体内存在两种高度同源的a和B亚型。GSK3在胰岛素、Wnt、Hedgehog、NGF、Reelin以及核因子等多种细胞转导途径中扮演着重要角色,对细胞增殖与分化、细胞的凋亡、肿瘤的发生等方面起着重要的调节作用。然而当其在体内表达不当时,将导致异常的生理功能,引起一系列如阿尔茨海默病(AD),癌症,、躁郁症、Ⅱ型糖尿病等疾病,已经成为受到广泛关注的药物靶点。本论文在已有的实验基础上,通过理论计算方法从分子层面上解释GSK3的结构与功能。1.在GSK3β中,保守的K85对GSK3β的活性和FRATide的结合非常重要。为了阐明GSK3B活性和FRATide的解离机理,我们对野生型(WT)和K85M突变体的GSK3B-FRATide复合物进行分子动力学模拟、MM_GBSA结合自由能计算和简振模式分析(NMA)。结果表明：在K85M突变体中,G loop的周期性开合构象变化和RD口袋的紧凑型构象被破坏,导致GSK3B失活。特别地,在K85M突变体中,GSK3B的正确折叠方式被破坏,导致GSK3B残基K214与FRATide残基E290和K292形成的两个氢键丧失。而且,MM_GBSA结合自由能计算表明K85M突变体得到能量不利的GSK3β-FRATide复合物。此外,NMA证实GSK3β的N-lobe和C-lobe区域存在摇摆运动,这些运动会使ATP结合口袋开合,使ATP分子进入ATP结合口袋和ADP分子离开ATP结合口袋。有趣的是,这些现象在K85M突变体中没有明显地观察到。这些研究提供了K85M突变使GSK3β失活和FRATide的解离的结构基础。2.与胰岛素信号通路相比,Wnt信号通路抑制GSK3β非预磷酸化底物的活性,而不会抑制GSK3β预磷酸化底物的活性。为了更好的了解FRATide抑制GSK3β的选择性机理,我们使用分子动力学模拟方法和MM_GBSA (?)吉合自由能计算方法研究FRATide双突变K214/A-E215/Q对GSK3B的结构影响。研究结果表明：在突变体体系中,预磷酸基团结合口袋、预磷酸底物结合口袋、ATP活性口袋残基取向以及ATP结合口袋的动力学行为几乎不受FRATide突变的影响,证明FRATide不会抑制GSK3B对预磷酸化底物的磷酸化。此外,结合自由能计算表明突变体体系得到能量不利的复合物,这会破坏FRATide的结合。3.蛋白激酶的底物特异性是信号通路完整性和保真度的基本原则。GSK3β对底物有独特的选择性。它需要P+4位点处的S/T预先被磷酸化,然后才能磷酸化P0位点处的S/T。GSK3β底物的典型模体为SXXXS(p),其中,S(p)代表预磷酸化位点。然而,GSK3β底物特异性的预磷酸化机理仍然不清楚。我们使用分子模建和分子动力学(MD)模拟方法来阐明GSK3β底物特异性的P+4预磷酸化机理。首先,我们使用分子模建方法构建一个GSK3β、ATP和磷酸化的糖原合成酶(pGS)的三元复合物(GSK3β/ATP/pGS)。然后,基于这个模型,我们对两个GSK3β/ATP/pGS和GSK3β/ATP/GS体系进行比较性的12ns MD模拟。与结构分析一致的是,结合自由能计算揭示pGS在预磷酸化状态下更有利于结合到GSK3B中。更重要的是,与GSK3β/ATP/GS体系相比,在GSK3β/ATP/pGS体系中,GSK3β的N-端和C-端区域的正确耦合促使磷酸根转移反应。而且,在预磷酸化体系中S0-Oγ...Pγ-ATP距离大大地缩短,方便磷酸根转移反应。4. GSK3β在调节许多重要的细胞信号需要两个Mg2+辅因子的参与。实验上,Li+是Mg2+的竞争性抑制剂,然而,其它第一主族金属离子不能取代Mg2+我们使用两层基于ONIOM的QM/MM方法和分子动力学(MD)模拟方法研究GSK3β…Mg2ATPM1(M=Mg、Li、Na、K和Rb)复合物来阐明金属离子取代对激酶活性的影响。ONIOM结果表明：Na+、K+和Rb+与ATP的作用比较弱,使ATP的三磷酸基团发生大的构象变化,使它们不能有效地与ATP配位。因此,这3种金属离子在活性口袋内不稳定,在MD模拟时会逃离活性口袋,对GSK3β没有抑制活性。比较GSK3β-Mg2+和GSK3β-Li+体系时,当Li+取代Mg12+时,ATP三磷酸基团的线性磷酸转移机制、残基Lys85与ATP β-和γ-磷酸基团形成的两个保守氢键以及活性口袋的静电势都被破坏,这会有效地抑制GSK3β的活性。5.水分子的重要性在药物设计方面已经越来越受关注,许多研究表明水分子能够对配体结合的特异性和亲和力有贡献。我们通过使用两层基于ONIOM的QM/MM计算、分子动力学模拟以及分子对接方法对蛋白质—抑制剂界面的桥水分子进行研究。ONIOM几何优化和AIM分析证实在氨基酸残基Thr138和/或Gln185附近存在保守水介导的GSK3β—抑制剂氢键网络作用。对1ROE代表性体系MD模拟证实桥水分子在GSK3B—抑制剂界面活性口袋里是稳定的,能够增加其周围氨基酸残基的稳定性,也能够稳定GSK3B—抑制剂作用。而且,分子对接研究表明：特别是对于柔性抑制剂,包含桥水分子的对接能够更好的重现实验的结合构象。桥水分子能够提高抑制剂分子的结合自由能。我们的结果表明桥水分子在GSK3β—抑制剂界面起着重要作用。6.卤—水—氢桥(halogen-water-hydrogen bridges, XWH bridges),其中—个水分子介导的常规氢键被卤键取代,是水分子的—种新的作用模式。我们通过两层基于ONIOM的QM/MM方法计算蛋白质—配体复合物。复合物的几何特征和能量行为分析以及AIM分析表明XWH桥在这些体系中存在。而且,研究表明卤—水—氢桥是一种新的作用力,它能够增强配体的识别和结合。