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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第五大常见恶性肿瘤,且位居肿瘤相关性死亡的第三位。以手术切除为主的综合治疗手段广泛应用于临床,然而,预后较差仍是亟待解决的问题,主要原因是术后肿瘤易复发转移,具体导致肿瘤复发及转移的机制目前尚不明确。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是指肿瘤组织中存在的少数具备高度增殖、自我更新能力及多向分化潜能的细胞,在启动肿瘤形成和生长中起着决定性作用。随着对CSCs研究的不断深入及从肝癌组织和细胞系中分离出肝癌干细胞,肝癌中存在肝癌干细胞的观点正被广大学者接受,这种细胞成瘤能力强,是肿瘤复发和转移的罪魁祸首。杀灭肿瘤干细胞或抑制其增殖可能是减少术后复发的关键,但这类细胞对放疗和化疗均不敏感,针对这类细胞目前缺少有效的治疗方法。环氧化酶(cyclooxygenase-2, COX-2)是一个非常重要的肿瘤相关基因,已证实COX-2在多种肿瘤组织中呈现高表达,它能够抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移,以及促进肿瘤血管生成,增强肿瘤细胞耐药性,与肿瘤发生发展密切相关。最新研究表明COX-2亦在调控CSCs增殖、自我更新、侵袭力及放疗敏感性等方面发挥重要作用。因此,以COX-2作为CSCs研究的一个切入点,有望为临床根治肿瘤和预防复发、转移提供新思路。研究发现COX-2抑制剂可明显降低罹患结肠癌、肺癌、乳腺癌及卵巢癌的风险,因而使用COX-2抑制剂预防肿瘤生长和复发有极大的潜在价值。目前,尚无相关研究证实COX-2参与调控肝癌干细胞,亦无相关研究报道COX-2抑制剂能够抑制肝癌干细胞特性,因此值得深入研究。一旦上述两个疑问被解开,将为应用COX-2抑制剂预防肝癌生长、复发和转移提供实验依据。一、高转移人肝癌细胞株HCCLM3中侧群细胞分离及干细胞特性鉴定目的：应用紫外光激发的流式细胞荧光活化分选法(fluorescence-activated cell sorting, MACS)分选高转移潜能人肝癌细胞株HCCLM3中的侧群细胞(side population, SP),并探讨其生物学特性。方法：常规培养不同转移潜能肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H、 MHCC97-L及Huh7,取对数生长期细胞消化、计数后制备单细胞悬液,分别予以不同终浓度荧光染料Hoechst33342染色,以维拉帕米拮抗组为对照。流式细胞仪检测Hoechst33342荧光,紫外光激发产生两种散射光信号,以Hoechst Blue为Y轴,Hoechst Red为X轴作二维散点图,将低Hoechst Blue及低Hoechst Red且对照组缺失的区域定义为SP细胞的“门”,多数细胞集中区域为主群(main population, MP)细胞。从肝癌细胞株HCCLM3中分选SP细胞和MP细胞,于荧光显微镜观察SP细胞及MP细胞内Hoechst33342染料荧光强度差异。应用体外培养实验观察SP及MP细胞的自我更新能力,CCK8细胞增殖及平板克隆形成实验观察SP及MP细胞的增殖及克隆形成能力,CCK8法观察化疗药物对SP及MP细胞生长的抑制作用,Transwell实验观察SP及MP细胞的迁移和侵袭能力,应用裸鼠皮下成瘤实验观察SP及MP细胞的致瘤能力；应用实时荧光定量PCR检测SP及MP细胞中干细胞相关基因Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall4表达情况,流式细胞仪检测SP及MP细胞中干细胞表面标记物ABCG2、CD133、CD90、EpCAM、CD13、CD44表达情况。结果：人肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及Huh7中均存在SP细胞,比例分别为(16.9+1.8)%、(8.4+0.7)%、(4.6+0.5)%、(1.0+0.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)；为满足后续实验要求,选择高转移人肝癌细胞株HCCLM3进行分选。荧光显微镜下观察SP细胞中Hoechst33342的荧光强度明显弱于MP细胞。体外培养时SP细胞可产生SP及MP细胞,而MP细胞不能产生SP细胞；SP细胞增殖能力明显强于MP细胞(P<0.05)；SP细胞形成的克隆球体积更大,结构更紧密,克隆形成率高达(35.6+4.4)%,明显高于MP细胞(10.2±3.1)%(P<0.05)；SP细胞具备较强的抵抗化疗药物作用(P<0.05)；Transwell实验提示SP细胞的迁移和侵袭能力均明显高于MP细胞(均P<0.05)；裸鼠皮下成瘤实验中5×103个SP细胞即可在4w观察期内形成皮下移植瘤,而MP细胞则需要5×105个才能形成皮下移植瘤。PCR结果示SP细胞中Nanog、Sox2、 Klf4、Sall4和Oct4 mRNA平均表达水平分别是MP细胞的3.78、2.37、2.92、1.83、1.46倍；流式细胞仪检测结果示SP细胞中干细胞表面标记物ABCG2、CD90及CD13的阳性表达率明显高于MP细胞(均P<0.05),SP和MP细胞几乎全部表达CD44,但不表达CD133和EpCAM。结论：不同转移潜能肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及Huh7中存在不同比例的SP细胞,可能与肝癌的转移潜能有关；应用MACS可稳定分选HCCLM3中的SP细胞及MP细胞。HCCLM3细胞中SP细胞富集了肝癌干细胞,可能与其较高的转移潜能有关。二、慢病毒介导COX-2过表达对肝癌干细胞生物学特性的影响目的：探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)在SP细胞及MP细胞中的表达情况；构建重组慢病毒COX-2基因过表达载体并感染高转移人肝癌细胞株HCCLM3,探讨COX-2过表达对SP细胞干细胞特性的影响及分子机制。方法：从肝癌细胞株HCCLM3中分选SP细胞和MP细胞。采用实时荧光定量PCR及Western blotting法检测SP细胞及MP细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达。另外,取对数生长期人肝癌细胞HCCLM3接种于培养板中,分为3组：感染COX-2基因重组慢病毒过表达载体为转染组(LV-COX-2组)；感染慢病毒空载体为阴性对照组(LV-NC组)；空白对照组不做任何处理。流式细胞仪分选三组细胞中SP细胞。采用CCK8细胞增殖及平板克隆形成实验观察SP细胞的增殖及克隆形成能力,裸鼠皮下成瘤实验观察SP细胞的致瘤能力。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定SP细胞培养上清中PGE2含量,实时荧光定量PCR及western blotting技术检测SP细胞中COX-2 PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表达情况。结果：PCR结果示SP细胞中COX-2 mRNA平均表达水平是MP细胞的17.45倍(P<0.05)；Western blotting结果示SP细胞中COX-2蛋白平均表达水平是MP细胞的9.23倍(P<0.05)。LV-COX-2/HCCLM3中SP细胞含量为(19.9+1.4)%,明显多于LV-NC/HCCML3(17.3±0.6)%及HCCLM3(16.9+1.8)%,差异有统计学意义(P<0.05)。LV-COX-2/SP细胞增殖及克隆形成能力均明显强于LV-NC/SP细胞和SP细胞(均P<0.05)；LV-COX-2/SP细胞形成裸鼠皮下移植瘤平均体积明显大于LV-NC细胞和SP细胞(均P<0.05)。 PCR及western blotting结果示LV-COX-2/SP细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达较LV-NC/SP细胞和SP细胞明显上调,而PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表达明显下调。LV-COX-2/SP细胞培养上清中PGE2含量较LV-NC/SP细胞及SP细胞明显增加(均P<0.05)。结论：COX-2过表达能够促进SP细胞干细胞特性,提示COX-2可能通过下调PTEN及PDCD4激活肝癌干细胞。三、COX-2选择性抑制剂塞来昔布对肝癌干细胞的抑制作用目的：探讨选择性COX-2抑制剂塞来昔布对SP细胞干细胞特性的影响。方法：从肝癌细胞株HCCLM3中分离SP细胞,采用CCK8法观察塞来昔布对其增殖能力的影响,平板克隆形成实验观察塞来昔布对其克隆能力的影响,Annexin V/7-AAD双染色法检测塞来昔布诱导其凋亡的情况。裸鼠皮下接种SP细胞后随机分为2组,实验组给予塞来昔布灌胃,对照组给予生理盐水灌胃,观察裸鼠皮下移植瘤形成情况。采用ELISA法测定SP细胞培养上清中PGE2含量,实时荧光定量PCR及western blotting检测SP细胞中COX-2、PTEN及PDCD4 mRNA及蛋白表达情况。结果：塞来昔布对SP细胞增殖有显著抑制作用,呈时间和剂量依赖性；塞来昔布明显降低SP细胞的克隆形成能力(P<0.05)；也能够诱导SP细胞凋亡,呈剂量依赖性。实验组及对照组裸鼠皮下均形成皮下移植瘤,但前者移植瘤平均体积明显小于后者(P<0.05)。经塞来昔布处理后,SP细胞中COX-2表达下调,而PTEN及PDCD4明显上调：随着药物浓度的增加,SP细胞培养上清中PGE2含量逐渐降低。结论：塞来昔布能够抑制SP细胞增殖及克隆能力,诱导SP细胞凋亡,并对裸鼠皮下移植瘤有明显抑制作用,说明塞来昔布可能通过上调PTEN及PDCD4抑制肝癌干细胞特性。