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【目的】
我们实验室的前期研究已从湛江红树林内生真菌拟茎点霉菌（Phomopsissp.)次级代谢产物中分离得到单体化合物细胞松弛素H（cytochalasinH,CyH），本文继续深入探讨CyH对肺癌细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）的影响及其潜在的分子机制，为将CyH发展为抗肺癌的潜在药物提供科学依据。
【方法】
1.CyH对肺癌细胞侵袭能力的影响：用不同浓度的CyH（0μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，用Transwell侵袭小室（上室加水化的Matrigel）模型分析CyH对肺癌细胞侵袭能力的影响。
2.CyH对肺癌细胞中EMT和干性标志物表达的影响：分别用CyH（0μmol/L、1.51μmol/L、3.13μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，收集细胞，采用蛋白质印迹法（Westernblotting）检测细胞中EMT相关蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin以及EMT相关转录因子Snail1、Slug、Twist1和干性标志物OCT-4、SOX-2、Nanog的蛋白表达情况，采用RT-qPCR分析E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail1、Slug、Twist1、OCT-4、SOX-2、Nanog的mRNA表达变化。
3.CyH对肺癌细胞中YAP/TAZ信号通路的影响：分别用CyH（0μmol/L、1.51μmol/L、3.13μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，收集细胞，采用Westernblotting检测细胞中Yes-associatedprotein（YAP）/transcriptionalco-activatorwithPDZ-bindingmotif(TAZ)信号通路相关蛋白YAP、TAZ、LATS1/2、MST1/2的表达情况，采用RT-qPCR分析YAP、TAZ、LATS1/2、MST1/2的mRNA表达变化。
4.YAP在CyH影响EMT相关蛋白表达中的作用：将siRNA-YAP瞬时转染到A549和NCI-H460肺癌细胞，采用Westernblotting分析YAP的沉默效果，再进一步分析YAP在CyH对EMT相关蛋白表达影响中的作用。
5.CyH对YAP和TEAD相互作用的影响：经预实验选用3.13μmol/L的CyH处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，收集细胞，采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测信号通路YAP/TAZ中YAP蛋白和TEAD蛋白的相互作用。
6.CyH对肺癌细胞成球能力的影响：经预实验验证后选用1.51μmol/L的CyH处理A549和NCI-H460肺癌细胞10d，荧光显微镜下观察肺癌细胞的成球情况。
【结果】
1.CyH对肺癌细胞侵袭能力的影响：当用CyH（0μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞后，其侵袭能力被明显抑制，同时，这种抑制作用呈剂量依赖性（P<0.05）。
2.CyH对肺癌细胞中EMT和干性标志物表达的影响：Westernblotting结果显示CyH抑制了N-Cadherin、Vimentin、Snail1、Slug、Twist1、Sox-2、Oct-4、Nanog蛋白的表达，而促进了E-Cadherin蛋白的表达，并且这些作用具有剂量依赖性(P<0.05)。RT-qPCR结果显示CyH抑制了A549和NCI-H460细胞中N-Cadherin、Vimentin、Snail1、Slug、Twist1、Sox-2、Oct-4、Nanog的mRNA表达，而促进了E-CadherinmRNA的表达，并且这些作用具有剂量依赖性(P<0.05)。
3．CyH对肺癌细胞中YAP/TAZ信号通路的影响：用CyH处理A549和NCI-H460细胞后，YAP、TAZ的蛋白和mRNA表达被抑制,而且这种抑制作用具有剂量依赖性(P<0.05)。另外，CyH促进了LATS1/2、MST1/2蛋白和mRNA表达，而且这种促进作用具有剂量依赖性(P<0.05)。
4．YAP在CyH影响EMT相关蛋白表达中的作用：转染siRNA-YAP后，抑制了CyH对EMT相关蛋白N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin表达的影响。
5.CyH对YAP和TEAD相互作用的影响：Co-Ip结果显示CyH抑制了A549和NCI-H460细胞中YAP蛋白和TEAD蛋白的表达，同时明显抑制了二者的相互作用。
6.CyH对肺癌细胞成球能力的影响：CyH明显抑制了A549和NCI-H460细胞的干细胞成球能力(P<0.05)。
【结论】
CyH可显著抑制A549和NCI-H460肺癌细胞的侵袭能力和EMT，其机制可能与抑制YAP/TAZ信号通路有关。
我们实验室的前期研究已从湛江红树林内生真菌拟茎点霉菌（Phomopsissp.)次级代谢产物中分离得到单体化合物细胞松弛素H（cytochalasinH,CyH），本文继续深入探讨CyH对肺癌细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）的影响及其潜在的分子机制，为将CyH发展为抗肺癌的潜在药物提供科学依据。
【方法】
1.CyH对肺癌细胞侵袭能力的影响：用不同浓度的CyH（0μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，用Transwell侵袭小室（上室加水化的Matrigel）模型分析CyH对肺癌细胞侵袭能力的影响。
2.CyH对肺癌细胞中EMT和干性标志物表达的影响：分别用CyH（0μmol/L、1.51μmol/L、3.13μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，收集细胞，采用蛋白质印迹法（Westernblotting）检测细胞中EMT相关蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin以及EMT相关转录因子Snail1、Slug、Twist1和干性标志物OCT-4、SOX-2、Nanog的蛋白表达情况，采用RT-qPCR分析E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail1、Slug、Twist1、OCT-4、SOX-2、Nanog的mRNA表达变化。
3.CyH对肺癌细胞中YAP/TAZ信号通路的影响：分别用CyH（0μmol/L、1.51μmol/L、3.13μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，收集细胞，采用Westernblotting检测细胞中Yes-associatedprotein（YAP）/transcriptionalco-activatorwithPDZ-bindingmotif(TAZ)信号通路相关蛋白YAP、TAZ、LATS1/2、MST1/2的表达情况，采用RT-qPCR分析YAP、TAZ、LATS1/2、MST1/2的mRNA表达变化。
4.YAP在CyH影响EMT相关蛋白表达中的作用：将siRNA-YAP瞬时转染到A549和NCI-H460肺癌细胞，采用Westernblotting分析YAP的沉默效果，再进一步分析YAP在CyH对EMT相关蛋白表达影响中的作用。
5.CyH对YAP和TEAD相互作用的影响：经预实验选用3.13μmol/L的CyH处理A549和NCI-H460肺癌细胞16h，收集细胞，采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测信号通路YAP/TAZ中YAP蛋白和TEAD蛋白的相互作用。
6.CyH对肺癌细胞成球能力的影响：经预实验验证后选用1.51μmol/L的CyH处理A549和NCI-H460肺癌细胞10d，荧光显微镜下观察肺癌细胞的成球情况。
【结果】
1.CyH对肺癌细胞侵袭能力的影响：当用CyH（0μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L）处理A549和NCI-H460肺癌细胞后，其侵袭能力被明显抑制，同时，这种抑制作用呈剂量依赖性（P<0.05）。
2.CyH对肺癌细胞中EMT和干性标志物表达的影响：Westernblotting结果显示CyH抑制了N-Cadherin、Vimentin、Snail1、Slug、Twist1、Sox-2、Oct-4、Nanog蛋白的表达，而促进了E-Cadherin蛋白的表达，并且这些作用具有剂量依赖性(P<0.05)。RT-qPCR结果显示CyH抑制了A549和NCI-H460细胞中N-Cadherin、Vimentin、Snail1、Slug、Twist1、Sox-2、Oct-4、Nanog的mRNA表达，而促进了E-CadherinmRNA的表达，并且这些作用具有剂量依赖性(P<0.05)。
3．CyH对肺癌细胞中YAP/TAZ信号通路的影响：用CyH处理A549和NCI-H460细胞后，YAP、TAZ的蛋白和mRNA表达被抑制,而且这种抑制作用具有剂量依赖性(P<0.05)。另外，CyH促进了LATS1/2、MST1/2蛋白和mRNA表达，而且这种促进作用具有剂量依赖性(P<0.05)。
4．YAP在CyH影响EMT相关蛋白表达中的作用：转染siRNA-YAP后，抑制了CyH对EMT相关蛋白N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin表达的影响。
5.CyH对YAP和TEAD相互作用的影响：Co-Ip结果显示CyH抑制了A549和NCI-H460细胞中YAP蛋白和TEAD蛋白的表达，同时明显抑制了二者的相互作用。
6.CyH对肺癌细胞成球能力的影响：CyH明显抑制了A549和NCI-H460细胞的干细胞成球能力(P<0.05)。
【结论】
CyH可显著抑制A549和NCI-H460肺癌细胞的侵袭能力和EMT，其机制可能与抑制YAP/TAZ信号通路有关。