1背景伤口愈合是创伤后引起的病理过程的总称,是以组织再生为主,许多因素共同参与机体自身修复的复杂过程。正常的创面愈合过程主要包括三个阶段：炎症反应期、细胞增殖期和细胞外基质重建期。皮肤创伤常常包括表皮、真皮甚至皮肤附属器的损伤,即存在细胞功能障碍或组织缺损。其愈合过程包括伤口早期止血,创面保护,炎症控制及多种组织细胞的增生,肉芽组织的形成,创缘的爬行收缩等。而内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞等细胞的增殖是形成肉芽组织的关键,也是伤口愈合的关键。影响伤口愈合的因素很多,如年龄、营养状况、创面大小和一些全身性疾病等。某些因素可致伤口经久不愈,属于临床治疗上的棘手问题。慢性难愈性伤口因其伤口内坏死组织、微生物感染、机体代谢等因素导致了细胞增殖的抑制,使其停留在炎症反应期,而不进入下一个阶段细胞增殖期。虽然新技术和新手段层出不穷,但是对于慢性皮肤溃疡等难愈伤口的治疗效果却仍然欠佳。有研究指出,到2030年,全球由于慢性皮肤溃疡而需要截肢的患者将比现在增加30%以上。因此,有必要进行更深入的研究和实践,开发符合临床要求和国际标准的促愈高效药物。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是目前研究的一个焦点。已有研究证实在不同的化学药物或细胞因子的作用下,MSCs可向表皮组织,骨组织,软骨组织,神经组织等分化。同时,MSCs在创伤愈合过程中扮演多种角色：够诱导新血管的产生；产生CD4+淋巴细胞趋化因子；表达趋化因子受体CCR7,参加细胞迁移过程；在烧伤患者中还能够补充纤维细胞；可以在伤口局部通过细胞间信号转导机制调整纤维细胞的运输、增殖和分化,促进伤口的愈合过程,减少瘢痕的形成。Nakagawa等人的研究表明,MSCs联合成纤维细胞生长因子可以加速皮肤伤口的愈合过程。已有将骨髓间充质干细胞应用于病人的临床报道,在深度烧伤患者的创面涂布自体的骨髓间充质干细胞悬液,能够促进皮肤再生和血管新生。目前MSCs在临床的推广和应用还存在着技术复杂、质量控制方法不成熟、费用昂贵等缺点,因此在离临床的普遍应用还有一段距离。蜕皮甾酮(ecdysterone, EDS)在动物体内又称β-蜕皮激素。它是一种昆虫变态激素,能刺激昆虫真皮细胞分裂,产生新的表皮,导致昆虫变态,调节昆虫新陈代谢。但它在植物界的分布较动物界更为广泛,且含量较高,资源丰富。目前所应用的蜕皮激素主要由植物中提取。蜕皮甾酮在脊椎动物中也是必需的物质。研究发现,它对高等动物也表现出较强的药理活性,而且副作用小。目前所知其作用主要有：1)促进核酸及蛋白质的合成；2)调节糖代谢；3)调节脂代谢；4)调节基因表达；5)改善免疫功能；6)抗氧化作用；7)促进缺血区血管的生成和侧支循环的建立；8)促进多种细胞增殖的作用等。国外体外实验表明,蜕皮甾酮可促进人表皮细胞的分化。本课题组的前期实验中还发现,蜕皮甾酮有刺激人脐静脉内皮细胞的增殖和分裂,降低肺血管通透性,促进兔皮肤缺损创伤愈合过程,促进人表皮干细胞及骨髓间充质干细胞的增值等作用。基于上述蜕皮甾酮在人体各系统中的作用,且其在自然界中的广泛性和应用前景,故其对于创伤愈合的治疗有很高的可行性。本课题组前期已研究证明蜕皮甾酮能有效促进创伤愈合,并已制作出有明显促愈作用的蜕皮甾酮乳膏。同时本课题组亦证明蜕皮甾酮能促进人骨髓间充质干细胞的增值。本实验采用新西兰大白兔皮肤深Ⅱ度烫伤模型,初步研究蜕皮甾酮联合骨髓间充质干细胞对实验性皮肤烫伤的促愈合作用,为蜕皮甾酮在临床创伤的应用提供依据。2目的初步研究蜕皮甾酮(EDS)联合骨髓间充质干细胞(MSCs)对促进家兔烫伤皮肤愈合的作用及可能的机制。3方法取健康新西兰大白兔18只,以戊巴比妥35mg/kg耳缘静脉注射麻醉,背部用10%硫化钠脱毛,以碘伏消毒皮肤后用控温烫伤仪100℃恒温、0.5KG皮肤压力接触12秒,形成成直径约2.0cm的圆形烫伤皮肤,造成烫伤模型,病理验证为深Ⅱ度烫伤。每只兔子均有4个创面,标记为A、B、C,D分别设为空白对照(A组,仅予一般消毒处理)、蜕皮甾酮溶液组(B组,烫伤皮肤涂布蜕皮甾酮溶液,溶液中的蜕皮甾酮含量约为25mg)、骨髓间充质干细胞悬液组(C组,烫伤皮肤涂布骨髓间充质干细胞悬液,悬液中的骨髓间充质干细胞数量约为1-2×106个)、蜕皮甾酮联合骨髓间充质干细胞组(D组,烫伤皮肤涂布蜕皮甾酮溶液+骨髓间充质干细胞悬液,每次涂布的蜕皮甾酮溶液中的蜕皮甾酮含量约为25mg,骨髓间充质干细胞悬液中的干细胞数量约为1-2×106个)。敷药后所有伤口均用凡士林油纱敷盖,再用干纱布包扎。伤口每天予盐水冲洗、酒精消毒后各用原法处理换药。每只兔分笼饲养。18只兔子分三次于烫伤后5d、10d、15d处死,每次6只。观察各组创面愈合率及创面组织肉眼变化情况,进行组间比较。取组织标本,常规HE染色、制片后,通过光镜观察组织切片病理学变化,并进行组织病理学评分及炎性细胞浸润度来评价治疗效果。计量资料均以x±s表示,采用SPSS 13.0统计软件分析处理数据(采用方差分析,包括One-Way ANOVA、Repeated Measures,其中两两比较用LSD或Tamhane’s T2检验)4结果在观察期间(0-15d),四组皮肤创面均随时间增加愈合率在提高,说明所烫伤型有一定的自然愈合能力。烫伤后5d,B组的创面愈合率高于A组(P<0.05),C、D组与A组之间无显著性差异(P>0.05)；烫伤后10d,各组之间的创面愈合率无显著性差异(P>0.05)；烫伤后15d,B、C、D组的创面愈合率均高于A组(P<0.05),其中D组创面愈合率与A组间的差异较其它组更显著(P<0.01),B、C、D组各组之间无显著性差异(P>0.05)。创面肉眼观察显示：烫伤后5d,各组创面无明显脓液形成,B组伤口收缩明显,其余各组伤口收缩不明显。A组的创面可见少许坏死组织,有明显炎症渗出液,量小,仅覆盖创面,创面下组织略水肿；B组的创面边界与周围正常组织分界清晰,伤口表面相对干燥,无明显渗出液,表皮开始向创面中心生长；C组创面无明显收缩,创面渗出明显,部分个体创面下组织轻度水肿；D组创面无明显收缩,创面渗出较少,创面下无明显组织水肿。烫伤后10d,各组伤口干燥结痂,无明显感染征象,伤口表面及皮下组织收缩明显；A、C、D组仍可见痂皮下少量渗出。烫伤后15d,B、C、D组伤口进一步收缩,创面干燥,无炎性渗出,表面结厚痂,未愈合面积较小,且各组痂皮均有不同程度的脱落；A组伤口面积较烫伤后5d、10d有明显收缩,创面结痂,无明显脱落,仍可见痂皮下少量渗出液,且仍有较大面积未愈合。创面组织切片光镜下观察显示：烫伤后5d,各组创面均以渗出和充血为主,肉芽组织增生较少；B、D组创面炎性细胞浸润程度显著性低于A组(P<0.01)；各组创面组织病理学评分无显著差别(P>0.05)。烫伤后10d,各组创面仍有充血渗出,肉芽组织形成较少,炎性细胞较前减少,胶原束较多,排列较有序,上皮细胞明显增生；各组创面组织病理学评分及炎性细胞浸润度均无显著差别(P>0.05)。烫伤后15d,B、C、D组创面有较多肉芽组织形成,真皮与表皮连接处少许炎性细胞浸润,大量胶原形成,排列有序,上皮细胞及纤维细胞增生明显；A组创面有较多肉芽组织形成,炎性细胞较少,但浸润范围广泛,胶原含量、上皮细胞及纤维细胞增生程度均低于B、C、D组；各组炎性细胞浸润度无显著差别(P>0.05)；B、C、D组创面组织病理学评分显著高于A组(P<0.01)。5结论蜕皮甾酮溶液、骨髓间充质干细胞悬液及蜕皮甾酮联合骨髓间充质干细胞均能促进家兔烫伤皮肤的愈合。而蜕皮甾酮在愈合早期便能有效的促进烫伤皮肤的愈合,其机制可能是由于蜕皮甾酮的早期局部抗炎作用,促进了肉芽组织形成,早期促进了上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的快速增殖,从而提高创面愈合速度和质量。另外,蜕皮甾酮联合骨髓间充质干细胞虽然比起单纯的蜕皮甾酮和单纯的骨髓间充质干细胞在促进创面愈合的作用上无显著性差距,但是在烫伤15天的模型中,创面愈合率均数较其他两种处理组高,且P值<0.01。因此可以设想,蜕皮甾酮联合骨髓间充质干细胞是否在更大样本量或更长期时间的处理后会体现出其更强的促进伤口愈合作用,此点设想可以在进一步的试验中进行验证。蜕皮甾酮联合骨髓间充质干细胞对家兔烫伤皮肤有抗炎及促愈合作用。