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目的：临床上胰岛移植的应用给I型糖尿病患者带来了希望,同时猪的器官在器官移植中的应用解决了捐赠器官严重短缺的问题。但是,无论是同种还是异种胰岛经门静脉移植,都面临着移植后早期快速的大量胰岛丢失的问题以及受体体内产生的免疫排斥反应最终导致移植物排斥。因此本研究：①利用siRNA对新生猪胰岛细胞团的TF目标基因进行特异性地表达沉默,分析TF对NICC与血液接触后发生的IBMIR的始动作用,探寻一种更为安全有效的措施来抑制IBMIR,减少胰岛的丢失提高胰岛的植入率；②应用NOD-SCIDIL2rγ-/-小鼠作为猪胰岛移植受体,研究注射人外周血单个细胞和体外扩增的nTregs后是否可以诱导以及如何诱导对胰岛移植物的免疫耐受,建立一种以经体外扩增培养的Tregs为基础的治疗方法用以抑制T细胞介导的异种移植排斥反应,从而减轻或消除免疫抑制治疗的需求,为人nTregs在临床移植治疗的实际应用提供了参考。方法和结果：1.新生猪胰岛细胞组织因子基因沉默本研究通过在新生猪胰腺原位及分离培养后的NICC免疫组织化学检测均可见TF呈阳性染色,从而证实猪的胰岛细胞自身就有TF的表达而不是因为细胞分离过程所导致的TF表达。本研究运用siRNA在基因水平上阻断猪胰岛细胞TF的表达,以抑制细胞与血液接触后触发的IBMIR,从而减少猪胰岛的丢失。实验设计了5条siRNA,单独或两两组合或三三组合按最佳转染条件分别转染NICC,结果发现其中三条siRNA组合可以使NICC的TF基因沉默效率达53%-70%,平均60%,p<0.01,且TF蛋白表达水平下降近50%。同时流式细胞仪检测结果显示,siRNA转染后,NICC的活性未受明显的影响,排除了因细胞死亡所导致NICC蛋白表达水平的降低。上述结果提示,设计的5条siRNA中有3条siRNA组合可显著降低NICC在基因及蛋白水平TF的表达,以便于进一步研究TF在IBMIR发生中的作用。2.新生猪胰岛细胞组织因子基因沉默体外抑制IBMIR本研究将未转染siRNA的NICC,转染对照siRNA的NICC和转染TF siRNA的NICC与人外周血在体外tubing loops模型内共孵育60分钟后,观察血凝块的大小及重量,血细胞计数检测血细胞的消耗,ELISA检测血浆中TAT及C3a的浓度,免疫组织化学检测中性粒细胞浸润及IgG沉积情况,Real-time PCR检测各组NICC的α-Gal基因表达。结果显示,转染TFsiRNA的NICC与人外周血共孵育后,不仅其血凝块的形成较其他两组受到明显的抑制,血凝块的大小和体积均有明显减小,而且血细胞计数显示血液中血小板、白细胞和中性粒细胞的消耗显著减少,补体激活受到明显的抑制。结果还显示,TF在NICC上的表达受到抑制后,血浆中TAT的浓度显著降低,中性粒细胞的浸润明显减少。上述结果提示阻断TF在胰岛上的表达可以抑制凝血、补体激活和前炎症介质的产生,也就抑制了IBMIR的发生。同时免疫荧光染色结果显示,NICC的TF表达降低并不能明显减轻血凝块中IgG在NICC周围的沉积,Real-time PCR结果表明TF特异性的siRNA对NICC TF基因的沉默作用没有影响到细胞a-Gal基因的表达,提示抗体介导的凝血激活通路并不是体外Loops模型中IBMIR发生的主要启动因子。3.人源化小鼠模型研究人调节性T细胞介导的异种胰岛移植耐受本研究在体外用CD4+CD25+CD 127dim/- Treg分离试剂盒从健康自愿者外周血单个核细胞分离获得CD4+CD25+调节性T细胞,应用IL-2,抗CD3/CD28抗体磁珠和雷帕霉素体外扩增纯化CD4+CD25+ Tregs,扩增后的Treg经流式细胞仪检测具有典型Treg的表型,其中CD4+CD25+Foxp3+的细胞达到90%以上；同时在体外检测扩增后的Treg的抑制功能。混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)的结果显示,体外扩增的Tregs可以明显抑制针对猪异种抗原的效应性T细胞的增殖效应；收集MLR各孔细胞培养上清并检测各种细胞因子的浓度,结果发现体外扩增的Tregs可显著抑制效应性T细胞分泌效应性细胞因子如IL-2和[FN-γ,而明显促进抑制性细胞因子IL-10的分泌,但细胞培养上清中TGF-β的浓度没有明显的变化。上述结果提示,经体外扩增体系扩增的Tregs具备调节性T细胞的表型和抑制功能。本研究体内实验是将分离培养的NICC移植至NOD-SCIDIL2rγ-/-受体小鼠的肾被膜下,于移植后的7天内,将1×107去除CD25+细胞的人PBMC或PBMC与2×106体外扩增的nTregs共同经尾静脉注射给接受NICC移植的NOD-SCID IL2rγ-/-小鼠体内。免疫组化用以检测移植物的存活情况,流式细胞仪检测人细胞植入情况,FACS和Real-time PCR分析移植耐受或排斥小鼠体内人nTregs的表型和基因表达。结果显示,仅接受NICC移植的NOD-SCID IL2rγ-/-小鼠,移植物可存活100天以上,免疫组化检测结果显示移植胰岛的胰岛素,胰高血糖素和生长抑素染色呈阳性,说明NOD-SCID IL2rγ-/-小鼠可以耐受猪胰岛移植物。NOD-SCID IL2rγ-/-受体小鼠静脉接受1×107去除CD25+细胞的人PBMC后,28天内免疫组化检测NICC移植物几乎被完全排斥,同时有较多的细胞浸润在移植部位,这些浸润的细胞经免疫组化进一步检测绝大部分为人CD45+细胞,其中包括CD4+及CD8+细胞,免疫荧光双染仅见CD4+细胞,未见CD4+Foxp3+细胞,流式细胞仪检测移植物浸润细胞表型的结果同样显示浸润的CD4+细胞中几乎没有CD25+Foxp3+双阳性细胞；而同时接受1×107去除CD25+细胞的人PBMC与2×106体外扩增的nTregs(?)植入的宿主小鼠NICC移植物却未被排斥,其存活时间不仅延长至100天以上,而且具有分泌胰岛素,胰高血糖素和生长抑素的功能,HE染色显示细胞植入28天可见有细胞围绕在胰岛的周围,但未浸润入胰岛中。这些围绕在胰岛周围的细胞经过免疫组化检测绝大部分亦为人CD45+细胞,其中包括CD4+及CD8+细胞,但免疫荧光双染结果显示在CD4+阳性细胞中,可见CD4+Foxp3+双阳性细胞。流式细胞仪检测移植物周围的细胞表型结果显示浸润的CD4+细胞中有高达18.6±2.3%的CD25+Foxp3+双阳性细胞。上述结果提示移植NICC的NOD-SCID IL2rγ-/-受体小鼠静脉接受1×107去除CD25+细胞的人PBMC后,人PBMC即可对猪异种抗原产生免疫应答而导致NICC移植物被排斥,参与免疫排斥的细胞主要包括CD4+和CD8+T细胞；如果同时植入体外扩增的自体2×106Tregs后,NICC移植物的排斥延迟,Treg抑制了自体PBMC对猪异种抗原产生的免疫应答而保护了NICC移植物。Real-time PCR检测NOD-SCID IL2rγ-/-受体小鼠移植部位浸润细胞基因表达水平结果同样显示Treg与PBMC共植入小鼠的Foxp3,CTLA-4及IL-10的基因表达水平明显高于仅接受PBMC植入小鼠的表达水平,p<0.01,但IFN-γ的表达水平却显著低于仅接受PBMC植入小鼠的表达水平,p<0.01；受体小鼠血清各种细胞因子浓度的检测结果显示,Treg与PBMC共植入小鼠血清中的IL-10的浓度明显高于仅PBMC植入小鼠血清IL-10的浓度,p<0.01,而IFN-γ的表达水平显著低于仅PBMC植入小鼠的表达水平,p<0.01。上述结果提示,Treg与PBMC共植入小鼠体内,Tregs可通过抑制效应性细胞因子IFN-y的表达,促进抑制性细胞因子IL-10的表达,从而抑制了人PBMC针对猪异种抗原产生的免疫排斥反应。结论：本研究应用TF siRNA特异性地抑制了NICC TF的表达,NICC TF的基因沉默能在体外抑制IBMIR的发生；人Tregs可抑制人PBMCs(去除CD25+细胞)介导的异种免疫排斥反应而保护NOD-SCID IL2rg-/-受体小鼠NICC移植物,且Tregs在体内的抑制功能与IL-10参与有关。拟人化NOD-SCID IL2rg-/-小鼠在胰岛异种移植中人Tregs介导的免疫耐受及其机制的研究中是一种非常合适的模型。