论文部分内容阅读
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,严重影响我国人民的身体健康。临床与流行病学资料表明：我国90%以上的肝癌发生于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染相关的慢性炎症基础之上。慢性HBV感染相关性肝癌组织中存在大量异质性的免疫细胞的浸润,这些浸润的免疫细胞的功能、表型特征以及细胞因子的产生和种类都发生了明显的变化,进而影响着肝癌的发生与发展。白细胞介素23(IL-23)是近年来发现的参与慢性炎症相关性肿瘤的重要炎性细胞因子之一,属IL-12细胞因子家族成员,由IL-23p19和IL-12p40两个亚基组成,在自身免疫性疾病、慢性炎症及肿瘤中均发挥重要作用。IL-23主要由单核巨噬细胞和树突状细胞产生,通过与由IL-12Rβ1和IL-23R两个亚基所组成的受体发挥作用,IL-23主要通过IL-23R发挥作用,激活STAT3信号通路,但是,持续性高浓度的IL-23还可通过IL-12Rβ1发挥作用,激活STAT4信号通路。其中IL-23R的表达在Th17的分化及其所介导的慢性炎症损伤和与多种肿瘤中发挥重要作用。但IL-23在慢性HBV感染相关HCC发展进程中的作用尚不明确。不同分化类型的CD4+Th细胞在抗病毒感染和抗肿瘤免疫中均发挥着关键性调控作用,我们首先利用1992年在江苏启东建立的慢性HBV感染者HCC筛查队列,参加人员每年进行随访,并保存随访过程中的血清样本。通过病例-对照研究,采用multiple ELISA技术,我们分析和比较了慢性HBV感染人群最终进展为肝癌者(50例)和通过随访10-15年仍然保持慢性HBV感染者(150例),在不同疾病进展阶段中,外周血血清中不同类型Th细胞相关的细胞因子的表达水平。结果发现最终进展为HCC患者的慢性HBV感染者外周血中Th17细胞相关细胞因子的浓度显著增加。通过对HBV病毒载量和细胞因子相关性分析以及比较有无肝细胞损伤患者血清细胞因子的水平,发现慢性HBV感染人群肝细的损伤状态与外周血IL-23的高水平相关。随后,我们通过分离健康人以及慢性乙肝患者的外周血单核细胞,培养并分化为巨噬细胞,利用永生化的人肝细胞系(L02)和转染了2xHBV的L02细胞(2xHBV-LO2)的细胞裂解液刺激巨噬细胞,结果显示巨噬细胞在受到上述两种细胞裂解液刺激后,IL-23产生均明显增加,但巨噬细胞IL-23的产生在受到2xHBV-LO2细胞裂解液刺激后升高更为明显,特别是在慢性乙肝患者中。进而,我们分析了仅含有HBV小S蛋白的表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和HBV核心抗原(hepatitis B core antigen, HBcAg)刺激巨噬细胞产生IL-23的能力,发现HBcAg能更有效地刺激慢性乙肝患者外周血巨噬细胞IL-23的产生。IL-23功能的发挥主要通过与不同细胞表面所表达的IL-23R结合而实现。通过流式染色分析发现,在肝癌组织中IL-23R主要表达于巨噬细胞,并且IL-23RmRNA的表达水平与VEGF mRNA水平呈显著正相关。由于HCC组织的高度血管化,我们探讨了IL-23在促进HCC进展中对血管形成的影响。利用人巨噬细胞系THP-1细胞,以及通过外周血单核细胞培养分化的巨噬细胞进行研究发现,IL-23/IL-23R通过正反馈作用能促进巨噬细胞产生和分泌VEGF,通过管道形成实验进一步证明,IL-23处理的巨噬细胞能够促进血管形成。最后,我们利用HBV转基因小鼠,在出生2周龄时腹腔注射二乙基亚硝胺诱导肝细胞的癌变,并分别在出生后的第6周龄、第1O周龄和第16周龄时腹腔注射抗IL-23R的中和性抗体,连续注射4周,结果发现从第6周龄和第10周龄开始阻断IL-23R,与同型抗体对照小鼠相比,小鼠肝脏肿瘤的数量(P=-0.0007)和肿瘤直径(P=0.0079)显著降低。同时,肝脏组织中VEGF mRNA水平和蛋白水平在阻断IL-23R后也明显下降。除此之外,肝脏浸润的免疫细胞阻断IL-23R后CD8+IFNγ+T细胞百分比明显增加,体外杀伤实验显示T细胞的杀伤能力明显增强。在本研究中,我们发现HBV抗原诱导巨噬细胞所产生的IL-23在促进慢性HBV感染相关HCC的发生发展中发挥着重要的作用。首先我们发现慢性HBV感染者进展为HCC的过程中IL-23明显增高,其次证明HBV核心抗原能够诱导巨噬细胞产生和分泌IL-23。随后,对IL-23促进HCC的机制进行进一步研究后发现IL-23通过自分泌的方式促进巨噬细胞产生和分泌VEGF,从而促进HCC的发生和发展。这为今后HCC临床诊疗提供了潜在的干预新靶点。