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微流控芯片(Microfluidic Chip)分析是微全分析系统(Miniaturized Total Analysis Systems,MTAS)或芯片实验室(Lab Chip)领域中的重要组成部分,其最终目标是在一块很小的芯片上实现分析实验室的所有操作,包括取样、试样引入、样品前处理、反应、产物分离和检测等。微芯片上基因分析的研究是目前微流控芯片分析系统领域内的重要研究方向之一,其目的就是有效地实现“样品进-结果出”的目标。本论文的研究内容即是进行基于微流控芯片的核酸纯化、在线扩增及产物在线检测的研究。
第一章详细综述了目前微流控芯片核酸抽提及其与后续基因分析单元相整合的研究进展。全面系统地介绍了目前应用于芯片核酸抽提的各种方法、芯片上的PCR扩增及等温扩增,以及各功能单元的整合。
在第二章的工作中,发展了一种基于玻璃的核酸抽提方法。利用玻璃的主要成分为二氧化硅这个特性,使核酸在高盐低pH环境中结合于玻璃表面,并在低盐环境中被洗脱。除了对商品化的λDNA进行纯化研究之外,还对诸如全血及细胞悬液之类的复杂生物样品进行了核酸抽提,并将该方法与商品化的微量DNA抽提试剂盒进行比较,考察了玻璃固相萃取柱的抽提能力。结果显示,该系统能够成功提取1μL全血、3200个细胞中的基因组DNA。该方法具有加工简单、纯化效果卓越、易于与其他分析单元相整合等优点。
第三章探讨了将核酸抽提与等温扩增相整合的可行性,优化了扩增反应室的结构,考察了洗脱液与扩增试剂的混合效果。
第四章的工作是在第二章和第三章工作的基础上,首次提出了一种基于玻璃徼流控芯片的整合基因分析系统,研制了集核酸抽提、环介导等温扩增及在线分析的整合芯片。直接利用玻璃的特性进行核酸抽提纯化,并采用扩增效率极高、且不需要热循环的环介导等温扩增作为核酸扩增方法。优化双链DNA插入性荧光染料的工作浓度,并考察了在线检测的可行性。最后将核酸抽提与环介导等温扩增与在线检测相整合,简单高效地实现了整合的基因分析。以商品化的λDNA为样品,考察了改系统的分析性能。该方法能够在2小时内完成从样品上样、核酸抽提、核酸扩增,到最后的扩增结果定性检测过程。