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目的：糖尿病骨髓间充质细胞(DM-BMSCs)功能受损是糖尿病骨再生修复障碍的主要原因,目前对于DM-BMSCs功能受损的具体调控机制仍未完全阐明,本研究首先通过体外实验研究Insulin-TGF-β1-SATB2通路调控自噬影响DM-BMSCs成骨分化的作用机制,然后通过动物实验研究阻断调控该通路对2型糖尿病颌骨再生修复的影响,本研究为探索促进糖尿病骨再生的新途径提供实验依据. 方法：1.高糖高胰岛素环境对健康骨髓间充质细胞自噬,衰老,成骨分化的影响(1)低糖(NG)及高糖(HG)环境培养骨髓间充质细胞(BMSCs)3天后利用荧光探针DCFH-DA进行细胞内活性氧(ROS)检测;(2)低糖(NG)及高糖(HG)培养3天后利用Western Blot检测自噬蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达f雷帕霉素RA为阳性对照),半定量分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,细胞免疫荧光技术分析LC3表达;(3)低糖(NG)及高糖(HG)培养同时加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml)3天后,Western Blot分析自噬相关蛋白LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ的表达,半定量分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值;(4)低糖(NG)及高糖(HG)培养同时加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml)3天后,SA-β-gal染色检测BMSCs衰老表型,定量分析阳性细胞数;(5)低糖(NG)及高糖(HG)培养同时加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml)3天后,Western Blot分析自噬相关蛋白LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ的表达,半定量分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值;(6)低糖(NG)及高糖(HG)培养同时加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml)培养3天后开始成骨诱导,成骨诱导7天后茜素红染色分析钙结节形成量并且半定量分析结果,Real time PCR检测成骨相关基因ALP,Runx2,Ocn,Opn的表达;(7)低糖(NG)及高糖(HG)培养同时加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml)培养3天加入人重组细胞因子TGF-β1(终浓度为5ng/ml)(雷帕霉素RA为阳性对照),无血清培养6小时后Western Blot分析自噬相关蛋白LC3,P62的表达,半定量分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62的表达;(8)低糖(NG)及高糖(HG)培养同时加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml)培养3天后,分别加入TGF-β1抑制剂(终浓度为5μM)和人重组细胞因子TGF-β1(终浓度为5ng/ml)同时开始成骨诱导,成骨诱导7天后Real time PCR检测成骨相关基因ALP,Runx2,Ocn,Opn的表达. 2.糖尿病与健康患者骨髓间充质细胞自噬、衰老及成骨分化的比较研究(1)无血清培养6小时后Western Blot检测自噬蛋白LC3和P62的表达,半定量分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,免疫荧光分析LC3的表达;(2)SA-β-gal柒色检测DM-BMSCs和BMSCs衰老表型,定量分析阳性细胞数;(3)成骨诱导7天后茜素红染色对比分析DM-BMSCs和BMSCs钙结节形成量,半定量分析;(4)Western Blot检测DM-BMSCs和BMSCs细胞TGF-B1信号通路相关蛋白TGF-β1,P-Smad3,Smad3及SATB2的表达. 3.Insulin-TGF-β1-SATB2通路对糖尿病骨髓间充质细胞自噬、衰老及成骨分化的作用及相关分子机制(1)高糖培养基中分别加入胰岛素f终浓度为200uIU/ml),TGF-β1抑制剂(终浓度为5μM)和人重组细胞因子TGF-β1(终浓度为5ng/ml),无血清培养6小时后利用Western Blot检测自噬蛋白LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ以及P62的表达,半定量分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62的表达;(2)高糖培养基中分别加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml),TGF-β1抑制剂(终浓度为5μM)和人重组细胞因子TGF-β1(终浓度为5ng/ml),培养3天后SA-p-gal染色检测衰老表型;(3)高糖培养基中分别加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml),TGF-β1抑制剂(终浓度为5μM)和人重组细胞因子TGF-β1(终浓度为5ng/ml),培养3天后开始行成骨诱导,诱导7天后用Western Blot检测成骨相关蛋白RUNX2,OSX,OPN的表达;(4)高糖培养基中分别加入胰岛素(终浓度为200uIU/ml),TGF-β1抑制剂(终浓度为5μM)和人重组细胞因子TGF-β1(终浓度为5ng/ml),培养3天后用Western Blot检测TGF-β1信号通路相关蛋白TGF-β1,P-Smad3,Smad3的表达,TGF-β受体I(TβRI)和TGF-β受体2(TβR2)的表达,以及SATB2的表达. 4.TGF-β1抑制剂对2型糖尿病大鼠颌骨骨缺损再生修复的影响(1)高糖高脂饮食结合STZ腹腔注射构建2型糖尿病大鼠模型;(2)下颌骨骨缺损模型构建,Western Blot检测术后3,7,14,21骨痂中TGF-β1的表达;(3)下颌骨临界骨缺损模型构建,DM-BMSCs+明胶海绵移植修复,术后l,3,5,7天局部注射TGF-β1抑制剂,8周后影像学以及组织学分析骨修复效果. 结果：1.高糖高胰岛素环境对健康骨髓间充质细胞自噬,衰老,成骨分化的影响(1)高糖促进BMSCs中ROS的表达;(2)高糖促进BMSCs衰老;(3)高糖促进BMSCs自噬;(4)高糖高胰岛素加剧BMSCs衰老;(5)高糖高胰岛素抑制BMSCs自噬;(6)高糖高胰岛素抑制BMSCs成骨分化;(7)TGF-1抑制BMSCs自噬激活;(8)抑制TGF-β1信号通路促进BMSCs成骨分化. 2.糖尿病与健康骨髓间充质细胞自噬、衰老及成骨分化的比较研究(1)与BMSCs相比,DM-BMSCs自噬能力下降;(2)与BMSCs相比,DM-BMSCs衰老表型增强;(3)与BMSCs相比,DM-BMSCs成骨分化能力下降;(4)与BMSCs相比,DM-BMSCs中TGF-β1信号高表达,而SATB2低表达. 3.Insulin-TGF-β1-SATB2通路对糖尿病骨髓间充质细胞自噬、衰老及成骨分化的作用及相关分子机制(1)胰岛素抑制DM-BMSCs自噬激活,当抑制TGF-β1信号通路可以提高其自噬激活能力;(2)胰岛素促进DM-BMSCs衰老,当抑制TGF-βl信号通路可以抑制其衰老;(3)抑制TGF-1信号通路可以提高DM-BMSCs成骨分化能力;(4)胰岛素促进TGF-β1信号通路,促进TβR2的表达;(5)TGF-β1信号通路负反馈调节SATB2的表达. 4.TGF-β1抑制剂对2型糖尿病大鼠颌骨骨缺损再生修复的影响(1)糖尿病骨折愈合早期高表达TGF-β1;(2)局部注射TGF-β1抑制剂促进糖尿病颌骨再生修复. 结论：1.高糖高胰岛素抑制BMSCs自噬,促进其衰老,抑制其成骨分化阻断TGF-β1信号通路可提高BMSCs在高糖高胰岛素环境下成骨分化能力;2.DM-BMSCs自噬能力下降,衰老表型增强,成骨分化能力下降,TGF-β1信号通路高表达;3.Insulin-TGF-β1-SATB2通路抑制DM-BMSCs自噬,促进其衰老,抑制其成骨分化;4.抑制Insulin-TGF-β1-SATB2通路可以促进DM-BMSCs移植后骨再生修复能力.