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S-腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5.1.6, Methionine adenosyltransferase, MAT)催化底物ATP和甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),是目前已知生物体内获得SAM的唯一途径。本实验室前期采用DNAShuffling技术对SAM合成酶进行体外进化,经筛选获得了一编码高酶活SAM合成酶的基因ds16,有效提高了重组Pichia pastoris胞内SAM合成。前期的实验表明dsl6与Saccharomyces cerevisiae来源的sam2基因同源性达99%,但在P. pastoris胞内表达后,DS16活性显著高于SAM2。为了研究重组酶DS16的特性从而揭示其酶活提高的机理,本课题通过围绕DS16在P. pastoris中的高效表达、分离纯化以及DS16的酶学性质开展研究,并对设计信号肽序列促进外源蛋白在P. pastoris中的分泌表达进行了尝试。首先,为了提高蛋白表达水平以及简化分离纯化过程,分别采用胞内、外两种表达策略,构建了DS16蛋白N端或C端带有组氨酸亲和标签(His-tag)的P. pastoris重组菌,并探讨其最佳表达方式。对各重组菌胞内、外蛋白及酶活检测的结果表明,DS16分泌表达菌株分泌水平普遍较低,胞内酶活达到胞外酶活的两倍以上,难以用于分离纯化；在DS16的N端或C端加上His-tag后,SAM合成酶活性下降为DS16的1/3左右。利用胞内表达重组菌G/pPIC3.5Kds16高效表达DS16,采用DEAE离子交换、苯基疏水层析两步层析,成功从细胞裂解液中分离纯化DS16,经超滤脱盐浓缩后,最终纯度达93%,比活达1.828 U/mg。对DS16进行了酶学性质的考察,发现其热稳定性大大高于S. cerevisiae来源的SAM2,推测是其表观酶活提高的主要原因。针对a-MF前导肽对DS16分泌效率低下的缺陷,利用已公布的P. pastoris全基因组序列,设计内源性的信号肽序列,尝试外源蛋白的分泌表达。以a-MF前导肽为对照,采用LacZ、egfp和ds16三个外源基因对内源性信号肽PIPA00211S的分泌性能进行考察。结果表明PIPA00211S的分泌效果不理想,但不同外源基因的分泌效果各不相同,并且不同程度影响了蛋白的表达水平。内源性信号肽促进蛋白分泌有待进一步的优化设计和研究。