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缺血性脑血管病占脑血管病绝大部分,其有效的治疗方法是及时的恢复缺血区域的血液灌注。然而,在脑缺血一段时间恢复再灌注后会导致再灌注损伤(Reperfusion Injury),因此需要采取有效的脑保护措施,尽可能的降低缺血再灌注损伤。研究表明,缺血预处理(ischemic preconditioning, IPR)和缺血后处理(ischemic postconditioning, IPO)均能有效减轻脑缺血再灌注损伤,但由于自身局限性使这两种方式在临床实践中的应用受到极大的限制。而在器官缺血后,在更能耐受缺血的远隔器官如肢体施行缺血后处理即远端缺血后处理(remote ischemic postconditioning, RIPoC),可控性强、操作方便,在临床实践中具有广泛的应用价值。虽然RIPoC对脑缺血再灌注损伤能够产生良好的保护作用且作用靶点多样,但其作用机制并未完全阐明。自噬(autophagy)在缺血再灌注损伤中发挥重要作用,但对于自噬在脑缺血再灌注损伤中起保护作用还是促进神经细胞死亡,目前的研究尚存在争议。现普遍认为：生理状态下,自噬在细胞内持续低水平进行以维持细胞正常功能；当细胞处于适度应激状态时,如氧化应激、缺血、饥饿等,自噬可以显著增强,以维持细胞的结构与功能；当细胞处于强烈应激状态下,过度自噬将会发生,从而使细胞失去活力。在机体处于健康状况下时,经氧化磷酸化反应线粒体能够为细胞正常活动提供能量和生物合成的底物,同时,线粒体代谢过程中ROS的异常积累会引起线粒体损伤；受损的线粒体通过自噬被选择性清除而维持细胞内环境的稳定,即线粒体自噬(mitophagy)。调控机体适度的自噬水平,特别是选择性调控线粒体自噬水平对维持细胞正常结构功能并防治一些疾病发生发展十分重要。研究表明,不论是IPR还是IPO均可通过调节细胞自噬水平来诱导对缺血神经元的保护作用。然而到目前为止,在脑缺血再灌注损伤过程中神经元的生存和死亡是如何通过自噬水平的高低来决定还不太清楚。远端缺血后处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用是否与调节线粒体自噬有关,尚无研究报道。Parkin与DJ-1为帕金森病相关蛋白,均可通过调控氧化应激水平而维持线粒体功能,并在调控的线粒体自噬中具有重要作用。本研究将在SD成年大鼠上,建立短暂性局灶性脑缺血再灌注模型及肢体远端缺血后处理模型,首先明确远端缺血后处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,然后应用线粒体自噬抑制剂研究Parkin/DJ-1调控的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻脑缺血再灌注中的作用,探讨其可能的作用机制,为其今后应用于临床提供理论指导和实验依据。本实验研究分为两个部分：1.远端缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。2. Parkin/DJ-1介导的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用。第一部分远端缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用目的：探讨RIPoC对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与氧化应激、神经元凋亡相关性方法：成年雄性SD大鼠39只,体重280-320g,采用随机数字表法,将其分为3组(n=13)：假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、I/R+远端缺血后处理组(I/R+RIPo组)。采用大脑中动脉阻断法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注开始时,I/R+RIPoC组立即夹闭双侧股动脉实行10min缺血/10min再灌注,共计3个循环。于再灌注24h,行神经功能缺陷评分(NDS)；采用TTC染色测定脑梗死体积,计算脑梗死体积百分比；TUNEL法检测缺血半暗区神经元凋亡情况；测定缺血半暗区SOD的活性及MDA、15-F2t-Isoprostane的含量。结果：1、RIPoC减轻缺血再灌注后脑梗死体积,改善大鼠的神经功能：S组大鼠脑组织TTC染色未见梗死灶,无神经功能障碍；与S组比较,I/R组、]I/R+RIPoC组脑梗死体积百分比、NDS评分显著升高(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组脑梗死体积百分比、NDS评分显著降低(P<0.05),表明RIPoC减轻了缺血再灌注后脑梗死体积,改善了大鼠的神经功能。2、RIPoC减轻大鼠缺血半暗区神经元凋亡,抑制氧化应激反应：与S组比较,I/R组、I/R+RIPoC组缺血半暗区神经元凋亡指数、MDA和15-F2t-Isoprostane含量显著升高,I/R组缺血半暗区SOD活性降低(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组缺血半暗区神经元凋亡指数、MDA和15-F2t-Isoprostane含量显著降低、SOD活性升高(P<0.05),表明RIPoC减轻了大鼠缺血半暗区神经元凋亡,抑制了氧化应激反应。结论：RIPoC可有效的减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,其与抑制氧化应激反应,减少神经元凋亡有关。第二部分Parkin/DJ-1介导的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用目的：探讨Parkin/DJ-1介导线粒体自噬在RIPoC减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用。方法：成年雄性SD大鼠96只,体重280-320g,采用随机数字表法,将其分为5组：假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、I/R+远端缺血后处理组(I/R+RIPo组)、I/R+RIPoC+线粒体自噬抑制剂组(I/R+RIPoC+M组)和I/R+RIPoC+生理盐水组(I/R+RIPoC+NS组)。采用大脑中动脉阻断法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注开始时,I/R+RIPoC组、I/R+RIPoC+M组和I/R+RIPoC+NS组立即夹闭双侧股动脉实行10min缺血/10min再灌注,共计3个循环；I/R+RIPoC+M组、I/R+RIPoC+NS组在缺血前5 min分别腹腔注射线粒体分裂抑制剂(mitochondrial-division inhibitor-1, Mdivi-1) 3mg/kg和等容量的生理盐水。于再灌注24h,行神经功能缺陷评分(NDS)；采用TTC染色测定脑梗死体积,计算脑梗死体积百分比；透射电镜观察缺血半暗区线粒体自噬体；流式细胞术检测缺血半暗区神经元线粒体膜电位和线粒体质量；Western blot法检测缺血半暗区LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Parkin和DJ-1蛋白表达水平,计算LC3-Ⅱ/Ⅰ比值；免疫荧光染色观察Parkin和DJ-1蛋白的亚细胞定位；LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、脑梗死体积百分比分别与Parkin和DJ-1蛋白表达水平行直线相关分析。结果：1、RIPoC减轻缺血再灌注后脑梗死体积,改善大鼠的神经功能,mdivi-1阻抑RIPoC的作用：S组大鼠脑组织TTC染色未见梗死灶,无神经功能障碍；与S组比较,其余4组脑梗死体积百分比、NDS评分显著升高(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS脑梗死体积百分比、NDS评分显著降低(P<0.05),表明RIPoC减轻了缺血再灌注后脑梗死体积,改善了大鼠的神经功能；与I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS组比较,I/R+RIPoC+M组脑梗死体积百分比、NDS评分显著升高(P<0.05),而I/R组和I/R+RIPoC+M组间脑梗死体积百分比、NDS评分比较差异无统计学意义(P>0.05),表明抑制线粒体自噬会阻抑RIPoC的脑保护作用。2、脑缺血再灌注诱导缺血半暗区神经元发生线粒体自噬,而RIPoC增加了缺血半暗区线粒体自噬的水平,mdivi-1阻抑RIPoC的这种作用：1)透射电镜显示：S组神经元细胞结构正常,线粒体膜完整,未见线粒体自噬体；I/R组可见典型双层膜包裹的线粒体自噬体,还可观察到线粒体自噬溶酶体以及自噬溶酶体内不能降解的线粒体残体。流式细胞术检测显示：与S组比较,I/R组缺血半暗区神经元线粒体膜电位和线粒体质量分别减低到56.5%和64.8%(P<0.05)。以上结果表明脑缺血再灌注显著诱导缺血半暗区线粒体自噬的发生。2)LC3-II/I比值的变化来评价自噬水平,与S组比较,其余4组缺血半暗区LC3-II/I比值升高(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS缺血半暗区LC3-II/I比值升高(P<0.05),表明RIPoC增加了缺血半暗区神经元自噬的水平；与I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS组比较,]I/R+RIPoC+M组缺血半暗区LC3-II/I比值降低(P<0.05),而I/R组和I/R+RIPoC+M组间LC3-Ⅱ/Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05),表明]mdivi-1阻抑RIPoC引起的缺血半暗区神经元自噬水平的增加。3、RIPoC上调大鼠脑缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达水平,mdivi-1未能抑制RIPoC的作用：与S组比较,其余4组缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达上调(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达上调(P<0.05),表明RIPoC上调大鼠脑缺血半暗区Parkin, DJ-1蛋白表达水平；I/R+RIPoC组、I/R+RIPoC+NS组、I/R+RIPoC+M组之间两两比较,Parkin、DJ-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),表明mdivi-1未能抑制IRIPoC对大鼠缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达水平的上调。4、免疫荧光染色观察Parkin和DJ-1蛋白的亚细胞定位,结果显示：与S组比较,I/R组黄色荧光在脑缺血半暗区神经元线粒体上显著增强,表明脑缺血再灌注诱导Parkin和DJ-1蛋白向线粒体转位；与I/R组比较,I/R+RIPoC组脑缺血半暗区神经元线粒体上黄色荧光也显著增强,表明RIPoC进一步促进Parkin和DJ-1蛋白向线粒体转位。5、大鼠脑缺血半暗区Parkin和DJ-1蛋白表达水平分别与LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、脑梗死体积百分比行直线相关分析,结果显示：大鼠脑缺血半暗区LC3-Ⅱ/Ⅰ比值与Parkin、DJ-1蛋白表达水平呈正相关,脑梗死体积百分比与Parkin、DJ-1蛋白表达水平呈负相关。结论：RIPoC减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,与其上调Parkin、DJ-1蛋白表达水平,促进Parkin、DJ-1蛋白向线粒体转位,从而增强线粒体自噬有关,即Parkin/DJ-1介导线粒体自噬参与了远端缺血后处理的脑保护作用。