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中国荷斯坦公牛的精液品质显著影响母牛的繁殖效率。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,候选基因法在遗传育种中得到了广泛应用。结合国内外相关研究,本研究拟选INCENP基因为候选基因,鉴定与种公牛精液品质相关的功能性SNPs,并分析功能性SNPs的分子调控机理。1.中国荷斯坦牛INCENP基因启动子活性分析根据生物信息软件预测,在INCENP基因5’侧翼区发现一个启动子区。通过构建缺失片段p GL3重组质粒,瞬时转染MLTC-1细胞,确定了5’侧翼区核心启动子位置位于g.-532~g.-145。同时,通过测序发现,在启动子区鉴定出两个SNPs:g.-556G>T和g.-692 C>T。运用SAS软件进行关联分析,结果表明g.-556 G>T与鲜精活力显著相关。另外,利用双荧光素酶报告基因的方法对5’端侧翼区所发现的2个SNPs进行了功能性实验验证,发现p GL3-TG载体的相对荧光素酶活性显著高于野生型的p GL3-CG的活性。推测,g.-556 G>T和g.-692 C>T为启动子区功能性突变位点,可通过调节启动子活性来调控INCENP基因表达,进而影响精液品质性状。2.中国荷斯坦牛INCENP基因可变剪切体的鉴定及相关SNP功能验证通过RT-PCR、克隆测序在中国荷斯坦牛睾丸组织中检测到1种新的INCENP可变剪接体,命名为INCENP-TV。利用q RT-PCR检测INCENP基因在心、肝、脾、肺、肾、睾丸中的表达水平。结果表明INCENP基因的表达没有组织特异性,但在脾和睾丸中的表达量显著高于其他组织。INCENP参考转录本(INCENP-reference)和新发现的可变剪切体(INCENP-TV),在成年公牛和新生公牛中都有表达,但在成年公牛中的表达量显著高于新生小公牛。另外,在成年公牛的睾丸中,INCENP-TV的表达量显著高于INCENP-reference,然而在新生公牛中差异不显著,推测INCENP基因可能与精子发生密切相关。为了探究可变剪切的产生机理,通过测序在第十一内含子发现一个SNP位点(g.19970 A>G)。利用ESEfinder 3.0软件预测分析发现,由于g.19970位点G等位基因的引入增加了SRSF1、SRSF1(Ig M-BRCA1)和SRSF5三种剪切蛋白的结合位点。通过转染实验、RT-PCR及克隆测序技术,发现g.19970位点为A等位基因时存在两种转录本,INCENP-reference和INCENP-TV;但是当A突变为G后,只检测到了INCENP-TV,所以推测此SNP可能增强了剪切因子的作用。另外,运用SAS软件进行关联分析,结果表明g.19970 A>G与鲜精活力显著相关。3.中国荷斯坦牛bta-miR-378对INCNEP基因3’UTR靶位点的调控分析通过测序,在INCENP基因3’UTR区发现一个SNP位点:g.34078 T>G。运用SAS软件进行关联分析,结果表明g.34078 T>G与鲜精活力显著相关。成熟miRNA可影响靶基因m RNA的表达水平,通过RNA22和RNAhybrid软件预测发现,bta-miR-378可以结合到INCENP基因3’非翻译区,且g.34078 T>G突变前后结合3’非翻译区能力有变化。分别将野生型和突变型的3’UTR连接到p MIR报告载体中,并且和btamiR-378载体共转染MLTC-1细胞,通过双荧光素酶报告系统分析发现,bta-miR-378可与INCENP基因的3’UTR区结合,并且发现突变型报告基因的表达量低于野生型,表明g.34078 T>G-GG与miR-378的结合能力比g.34078 T>G-TT强。由此推测,btamiR-378可与INCENP的3’侧翼区结合,从而降低INCENP基因的表达水平。4.中国荷斯坦牛INCNEP基因单倍型组合与精液品质的相关性分析根据鉴定出的g.-556 G>T、g.-692 C>T、g.19970 A>G和g.34078 T>G构建单倍型组合,在实验群体中发现7种单倍型和13种单倍型组合。关联分析结果表明,H1H12和H2H2个体的射精量显著高于H2H10和H11H11;H11H11和H2H10鲜精活力显著高于H2H2。由此推测g.-692 C>T、g.-556 G>T、g.19970 A>G和g.34078T>G为功能性SNPs,在调控精液性状方面具有重要的作用。5.中国荷斯坦牛INCENP基因不同单倍型组合个体m RNA表达水平通过q RT-PCR评估INCENP基因不同单倍型组合个体的m RNA表达水平。结果表明,单倍型组合个体H11H11(TTTTGGTT)和H1H12(CTGTAGTG)的m RNA表达量显著高于H2H10(CTGTAAGG),H2H2(CCGGAAGG)和H9H12(TTTTAGTG),推测SNPs,g.19970 A>G,g.34078 T>G,g.-692 C>T和g.-556 G>T,为INCENP基因的功能性SNPs,可调控INCENP基因的表达水平。