由于肿瘤发生机制的复杂性和治疗的困难性,基因和化疗药物共给药技术(gene/drug co-delivery)成为近年来肿瘤治疗研究的前沿。基因和化疗药物共给药具有提高基因转染效率和增加药物疗效的协同效应,可增加肿瘤治疗效率。实现基因和化疗药物共给药的挑战之一是共递送系统的设计与开发。有效的递送系统要跨越体内、胞内的各种屏障,才能递送药物至肿瘤细胞内靶位,发挥抗肿瘤作用。因此有效的药物传递系统必须具备多功能,如稳定的长循环功能,特异识别位点的靶向功能以及有效的内吞体逃逸功能等。合成功能单元,采用超分子组装技术,将多个功能单元有序组合的程序组装技术是获得多功能载体的有效手段之一。由于有序自组装载体具有合适的纳米尺寸和可控的结构,具备跨越细胞膜,内吞体膜及核膜等系列屏障的能力,显示出巨大的发展潜力及应用前景。本课题利用有序组装技术构建了新型多功能自组装纳米载体,以实现化疗药物和基因共递送。以多柔比星(Doxorubicin, DOX)为模型药物,具有质子海绵效应的基因递送材料聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI)和细胞膜穿透肽TAT为主要材料,设计合成了pH敏感前药聚合物：多柔比星-腙键-聚乙烯亚胺-聚乙二醇-TAT (DOX-PEI-PEG-TAT, DPPT),作为化疗药物DOX的载体,pH敏感的DPPT能有效控制药物在酸性环境下释放,提高药物对肿瘤组织的选择性；利用DPPT中PEI骨架压缩DNA获得DOX和DNA共载的自组装纳米载体(DOX and DNA co-loaded self-assembly nanocarriers, DDN);以天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine, NGR)肽为靶向因子,介成pH敏感靶向材料：磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine,SA)-聚乙二醇-NGR (SA-PEG-NGR, SPN), SA具有pH敏感性,pH>7.0荷负电,可自组装到荷正电的DDN表面,得到DOX和DNA共载的靶向自组装纳米载体(Targeted DOX and DNA co-loaded self-assembly nanocarriers,TDDN), NGR可特异性靶向肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面高表达的CD13,赋予TDDN主动靶向功能。该靶向自组装纳米载体不仅可药物、基因共载,还具有NGR介导的主动靶向性、SA介导的肿瘤微环境pH敏感外壳脱落作用、TAT的高效穿膜作用、PEI的溶酶体逃逸作用和腙键介导的肿瘤微环境pH敏感释药功能等,是一个真正意义上的多功能载体。药物的靶点往往位于细胞内,因而细胞内机制的阐明对于药物递送研究是不可忽视的,新型药物递送系统的设计要建立在对细胞内过程充分了解的基础之上。本课题在载体构建基础上,选择CD13阳性HUVEC和MCF-7细胞、CD13阴性HepG2细胞,研究多功能自组装纳米载体的细胞摄取、细胞内药物释放、入胞动力学及入胞机制等,对载体入胞过程进行初步探讨。通过HUVEC膜表面CD13和小窝蛋白-1(Caveolin-1, CAV-1)共定位实验,考察并验证了NGR介导TDDN可利用小窝蛋白介导内吞途径入胞,从而避免溶酶体对所负荷基因药物的降解,为探索新的基因胞内递送途径奠定实验基础。首次利用体外模型探讨了多功能自组装纳米载体的体内过程。采用HUVEC作为微血管壁模型,HUVEC与肿瘤细胞以非接触共培养方式模拟体内肿瘤部位的微环境,表征TDDN穿透血管单层内皮细胞、进入肿瘤细胞的过程,表明本文设计的新型多功能自组装纳米载体具备肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的双靶向能力,可利用小窝蛋白途径入胞,高效递送化疗药物和基因药物。综上,本研究通过新型多功能药物/基因共递送系统的构建、载体性质考察、功能验证以及细胞内递送机制等研究,为基因和药物共给药深入研究及未来应用奠定基础。课题主要研究方法与结果如下：1新型功能材料合成与性质评价利用有序组装技术构建多功能药物和基因共递送载体,首先要合成载体的组装元件。本文设计合成了具有穿膜功能的聚乙烯亚胺-聚乙二醇-TAT (PEI-PEG-TAT, PPT),核磁共振氢谱验证其结构,计算PEI、PEG、TAT之间摩尔比为1：13：2。通过pH敏感腙键与抗肿瘤药物DOX连接,得到阳离子聚合物前药DPPT。核磁共振氢谱验证DPPT结构,紫外分光光度法测得DPPT中DOX载药量为8.01+1.22%(DOX与聚合物的质量比)。体外药物释放结果显示,pH7.4时DOX从DPPT中释放速率(48h,32.8±3.25%)明显慢于pH5时(48h,70.7±5.78%)(P<0.01),表明DPPT具有pH敏感性；酸碱滴定实验结果显示,pH5.1-7.4.范围内DPPT具有较好缓冲能力(21.5%),但略低于PEI25K(25.8%)。 MTT实验结果显示,实验条件下PPT对肿瘤细胞MCF-7、HepG2和正常细胞HUVEC的毒性较PEI显著降低(P<0.01),表明材料安全性好；DPPT对肿瘤细胞MCF-7、HepG2的细胞毒性较PPT增强(P<0.05),说明与材料的结合不影响DOX发挥药效；DPPT对肿瘤细胞MCF-7、HepG2的毒性较游离DOX低,可归因于DOX从DPPT中释放缓慢。细胞摄取实验结果显示,pH5条件下较pH7.4条件,DPPT更容易释放出游离药物,进一步验证DPPT的pH敏感性。合成靶向材料SPN,核磁共振氢谱验证其结构正确。通过MTT法考察了其细胞毒性,在考察浓度范围内,SPN对肿瘤细胞MCF-7、HepG2和正常细胞HUVEC无明显毒性。综上,所合成载体组装材料均具备载体构建所需功能,为进一步研究多功能自组装纳米载体奠定了基础。2多功能自组装纳米载体构建和体外药物/基因共递送本文通过有序自组装方法构建多功能自组装纳米载体。首先,DPPT与DNA静电压缩得到DDN,在此基础上组装SPN得到TDDN。琼脂糖凝胶电泳结果表明,当DPPT/DNA的质量比大于等于25：16时,DPPT能将DNA完全压缩。外层加入SPN不会引起自组装纳米载体的解体。以粒径、zeta电位、细胞毒性和转染效率为考察指标,优化多功能纳米载体的组装处方和工艺,确定DPPT/DNA质量比为12.5、SPN/DNA质量比为6.25,DPPT/DNA/SPN的质量比为50：4：25。以最优处方、工艺制备的DDN和TDDN均呈较圆整的球形,稳定性较高,能够保护DNA免受核酸酶和血浆成分的降解；粒径分别为108.4±4.2nm和199.8±9.2nm,粒度分布较窄；zeta电位分别为+10.08±0.58mV和+4.390±0.83mV。转染剂量下,DDN和TDDN在CD13阳性MCF-7细胞中的转染效率分别为38.34±2.3%和28.54±3.1%,TDDN的转染效率是DDN的1.3倍(P<0.05)；CD13阴性HepG2细胞中的转染效率分别为22.89±4.5%和19.49±5.6%,TDDN在CD13阳性MCF-7细胞中的转染效率是CD13阴性HepG2细胞中的1.7倍(P<0.05),表明NGR修饰能够有效提高载体在CD13阳性MCF-7细胞中的转染效率。TDDN能成功将药物DOX和模型基因pEGFP质粒递送到同一细胞中,说明TDDN具备实现药物/基因共递送的潜力。3多功能自组装纳米载体细胞摄取和入胞机制研究药物载体的合理构建应建立在对载体的入胞途径、药物释放机制等充分了解基础之上。本文研究多功能自组装纳米载体TDDN细胞摄取和入胞机制。体外细胞摄取实验结果表明,DDN和TDDN能被HUVEC、MCF-7和HepG2细胞快速摄取。TDDN在CD13阳性细胞中的摄取量明显高于CD13阴性细胞(P<0.05),表明TDDN具有靶向CD13的功能；与DDN孵育后,HUVEC、MCF-7和HepG2细胞中的荧光强度无明显差异(P>0.05),说明DDN无细胞特异性。为考察DDN和TDDN在HUVEC中药物释放情况,采用Hoechst33342对细胞核染色,发现DDN和TDDN与细胞孵育后能够释放药物,释放的DOX可成功入核。入胞动力学实验结果表明,TDDN入胞为时间依赖性和温度依赖性过程。为了考察NGR介导细胞摄取的特异性,用过量游离NGR(1mg/mL)饱和细胞表面CD13受体后,进行入胞竞争抑制实验。结果表明,在过量游离NGR存在下,HUVEC对TDDN的摄取受到明显抑制(P<0.01),说明TDDN通过CD13介导内吞途径入胞；游离NGR与TDDN竞争细胞表面CD13受体,TDDN进入CD13阳性细胞中涉及NGR介导的主动靶向机制。内吞抑制实验结果揭示,TDDN进入HUVEC细胞为笼形蛋白介导内吞和小窝蛋白介导内吞相结合的机制,但以小窝蛋白介导内吞途径为主。TDDN进入HepG2细胞主要涉及笼形蛋白介导途径和巨型胞饮途径两种机制,但以笼形蛋白介导途径为主。由此可见,载体类型和细胞类型均对纳米载体的入胞途径有着重要的影响,NGR修饰改变了载体入胞的途径和机制。4NGR介导多功能自组装纳米载体的小窝内吞过程基因药物递送系统研究中,小窝内吞途径由于能够有效避免溶酶体途径,避免基因药物在溶酶体内的降解而备受关注。随着小窝内吞途径对于基因递送的重要性的逐渐显现,如何利用小窝内吞途径成为基因药物递送研究的焦点。NGR能特异性靶向CD13,有研究报道,大多数细胞中CD13能与小窝蛋白-1(caveolin-1,CAV-1)发生共定位,因此我们推断NGR能够介导载体通过小窝内吞途径进入CD13阳性细胞。本文选择HUVEC为实验细胞,利用流式细胞技术和激光共聚焦技术来验证这一推论。流式测定结果表明HUVEC表面同时表达CD13和CAV-1。利用荧光显微镜观察到CD13在HUVEC膜上呈点状分布,在细胞膜细丝突出部位高表达,在细丝上也有表达。CD13和CAV-1共定位实验中,分别利用CD13和CAV-1特异性抗体标记CD13呈红色,同一细胞被标记的CAV-1呈绿色,两者叠加后无明显黄色荧光出现,说明CD13与CAV-1未共定位；细胞在37℃孵育10min,标记的CD13在细胞膜上呈均匀点状分布,未与CAV-1共定位；37℃继续孵育至30min时,HUVEC表面CD13和CAV-1开始聚集,呈斑点状分布,共定位现象开始发生；37℃继续孵育至60min时,共定位程度增加；37℃孵育至2h和3h时HUVEC表面CD13和CAV-1聚集成团簇,共定位程度进一步增加。与TDDN(?)孵育后,TDDN能促进CD13与CAV-1共定位的速度和程度。通过研究TDDN与CD13相互作用,发现TDDN能与CD13结合,并能通过CD13介导的受体内吞途径与CD13一起入胞。TDDN也能与CAV-1发生结合并一起入胞,说明CD13介导的受体内吞途径为小窝内吞途径。由此推断,TDDN与细胞孵育后,引起CD13聚集并与CAV-1共定位,进而引发后续的小窝内吞过程。CD13酶活性抑制实验结果表明,HUVEC对TDDN的摄取能力不受CD13酶活性影响。为进一步确定小窝在载体入胞过程中的重要作用,选择甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin, MβCD)对细胞进行处理,以去除生物膜中的胆固醇,选择性破坏小窝形成。结果发现,胆固醇被破坏后,直接影响细胞对TDDN的摄取作用,并对CD13和CAV-1共定位产生影响,证明小窝蛋白介导内吞途径的确在TDDN入胞过程中发挥重要作用。5体外模型预测多功能自组装纳米载体体内靶向递送过程本文设计的多功能白组装纳米载体可靶向于CD13阳性的血管内皮细胞和肿瘤细胞。在体内运输中,多功能自组装纳米载体需经血液循环到达肿瘤微环境,再渗出血管(extravasation),才能到达肿瘤组织,进而进入肿瘤细胞。因此本部分构建体外肿瘤微环境模型,采用激光共聚焦技术探讨和研究多功能自组装纳米载体的体内靶向递送过程,为高效基因／药物共递送载体的设计提供理论依据。首次利用体外模型探讨了多功能自组装纳米载体的体内过程。采用HUVEC细胞作为血管壁模型,首创HUVEC与肿瘤细胞以非接触共培养的方式来模拟体内肿瘤部位的微环境。实验结果表明,部分TDDN能够以完整形式穿过HUVEC细胞单层后,通过NGR介导内吞过程高效进入CD13阳性MCF-7细胞。TDDN在HUVEC细胞内过程结果表明,部分TDDN在HUVEC内经历了pH逐渐降低的过程,由此推断,虽然小窝内吞途径是TDDN进入HUVEC的主要途径,仍有部分TDDN经历笼形蛋白介导的内吞过程,与前面研究得到结果相一致。在偏酸性培养基(pH6.5)培养肿瘤细胞MCF-7时,细胞内观察不到NGR的绿色荧光,仅有DOX产生的红色荧光出现,表明TDDN外层SPN层在载体入胞前脱落。因此我们推断：TDDN可由NGR介导主动靶向浓集于肿瘤微环境,一部分可通过EPR效应被动靶向到肿瘤组织,在肿瘤组织弱酸性环境下,脱落SPN层,暴露TAT,从而介导载体进入肿瘤细胞；TDDN还可通过NGR与HUVEC表面CD13结合并进入HUVEC;进入HUVEC的纳米载体大部分以小窝途径入胞：其中部分可避免溶酶体途径,直接在胞浆内释放负荷基因和药物；另一部分可通过内皮细胞特有的小窝蛋白介导转胞吞作用到达肿瘤间质,然后通过CD13介导主动靶向内吞作用进入肿瘤细胞,对肿瘤细胞发挥药效；进入HUVEC的TDDN也有部分经历笼形蛋白内吞过程,借助PEI的质子泵效应,发生溶酶体逃逸并释放药物,对肿瘤血管内皮细胞发挥治疗作用。综上,本研究构建的多功能自组装纳米载体同时运载化疗药物和基因药物,具有被动和主动肿瘤靶向功能,可同时作用于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞,并可以发挥细胞穿透功能、pH敏感药物释放等功能,真正实现了多功能化,为肿瘤治疗提供了一种新思路、新工具和和新手段。