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胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs),是从植入前囊胚期胚胎的内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)中分离出来的一种具有多向分化潜能的细胞。胚胎干细胞具有自我更新、无限增殖和分化形成机体所需各种类型细胞的能力,是揭示胚胎发育机制和再生医学研究的细胞模型。然而,胚胎干细胞的自我更新和分化机制尚未明确,这显著制约着胚胎干细胞在生物医学领域中的广泛应用。已有研究证实,Tgf-β信号通路能够促进胚胎的分化。但抑制Tgf-β信号通路是否有助于胚胎干细胞多能性的维持目前还存在争议。4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物(SB431542)是Tgf-β-Smad2/3通路的特异性抑制剂。SB431542与Tgf-βⅠ型受体Alk4、Alk5和Alk7的ATP结合结构域结合,抑制Smad2/3的磷酸化,并阻止Tgf-β通路信号的转导。研究显示SB431542有助于胚胎干细胞多能性的维持,能够提高诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells,i PS)的形成效率,但相关机制尚不明确。为揭示SB431542对胚胎干细胞多能性的调控作用,明确Tgf-β信号抑制对胚胎干细胞多能性的影响,本文以小鼠J1胚胎干细胞为研究材料,利用表达谱芯片技术、高通量测序技术和一些分子生物学研究技术探究SB431542对小鼠胚胎干细胞多能性的调控作用。本文的主要研究内容和结果如下:1.无饲养层条件下,检测SB431542能否抑制Smad2/3蛋白质的磷酸化、维持小鼠ES细胞的多能性。蛋白质磷酸化Western blot和CCK-8细胞增殖检测结果显示,SB431542可抑制Smad2/3蛋白质的磷酸化,且对J1细胞的增殖活性无影响。无饲养层条件下,J1 ES细胞倾向于分化,干性促进因子BIO、CHIR99021和SC1都能增强J1 ES细胞的胞间连接作用,使其呈紧密的克隆状生长。用SB431542培养J1细胞时发现:LIF存在的条件下,SB431542能增强J1小鼠胚胎干细胞的胞间连接作用使其呈典型克隆状生长;无LIF的条件下SB431542可也可阻碍J1细胞的分化。对主要干性调控基因和分化促进基因的q PCR检测结果显示:SB431542对核心干性调控基因Oct4、Sox2和Klf4的表达无影响,但可以抑制三胚层分化基因T、Nestin和Gata4的表达。因此,在无饲养层条件下SB431542可以抑制Smad2/3蛋白质磷酸化,也能够维持小鼠ES细胞的未分化状态。2.在基因组水平上研究SB431542对小鼠胚胎干细胞多能性的调控作用。实验用表达谱芯片技术检测了对照和SB431542处理的J1小鼠胚胎干细胞内全基因组基因的表达。基因的差异表达分析结果显示:SB431542未增强主要干性调控基因的表达,但提高了其它干性相关基因如Dppa3、Klf2和Nr5a2等的表达量;SB431542对分化相关基因如T、Fgf8和Gata4等的表达具有抑制作用。对SB431542调控基因的GO和KEGG富集分析结果显示:SB431542可通过基因转录调节、生物粘附和胞内信号传递过程调节胚胎干细胞的多能性。在信号转导过程中SB431542除影响Tgf-β通路外还可通过MAPK通路、Erb B通路、VEGF通路以及细胞粘附通路等调节小鼠胚胎干细胞的多能性。用DLR检测SB431542对不同信号通路活性的影响时发现,SB431542抑制了具有分化促进作用的JNK和MAPK/ERK的活性。此外SB431542还抑制了JAK/STAT通路的活性,这一结果与SB431542对c-Myc表达量的下调、在无LIF条件下不能维持ES细胞的未分化状态一致,说明SB431542可以抑制ES细胞的分化,但它对ES细胞的多能性也有“负作用”,不能在无LIF的条件下维持ES细胞的多能性。3.探究SB431542对分化相关通路活性的调节。SB431542可以降低Smad1/5/8通路的抑制性蛋白Smad7的表达,通过基因的体外克隆、过表达和蛋白质磷酸化Western blot检测实验发现,SB431542在降低Smad2/3蛋白质磷酸化的同时可通过抑制Smad7基因的表达激活Smad1/5/8-Id通路,最终发挥分化抑制作用。另外,SB431542对神经分化相关基因和通路有抑制作用。SB431542下调了RA通路相关基因的表达,体外用RA诱导J1细胞分化时,SB431542的添加能够阻碍J1细胞向神经细胞的分化,同时也可降低RA诱导基因的表达。另外,受SB431542调控的9个Fgf家族基因在SB431542处理的J1细胞中表达量均下调,其中包括对ERK通路具有激活作用的Fgf4。4.通过全基因组mi RNA的表达变化验证SB431542对小鼠ES细胞的分化抑制作用。SB431542处理J1小鼠胚胎干细胞24 h后,用深度测序法检测J1细胞全基因组内mi RNA的表达变化。结果显示SB431542在小鼠胚胎干细胞mi RNA的表达过程中主要发挥表达抑制作用,在SB541542调节的114个mi RNA中仅有4个mi RNA被上调。除去直接受Tgf-β-Smad2/3信号调节的mi RNA,SB431542下调的mi RNA主要是一些能够抑制多能性维持和促进胚胎干细胞分化的mi RNA,说明SB431542主要通过分化抑制维持胚胎干细胞的多能性。总之,本研究显示,LIF存在的条件下SB431542可用于胚胎干细胞的体外无饲养层培养。SB431542可以维持胚胎干细胞的多能性:ES细胞生长过程中SB431542不能增加主要干性基因的表达,但可以抑制分化相关基因、mi RNA和信号通路的活性。SB431542主要通过抑制分化维持胚胎干细胞的未分化状态。