金翘热毒清颗粒主要由大青叶、金银花、连翘、生石膏、荆芥、薄荷、钩藤、蝉衣、玄参、芦根、前胡、霍香、神曲、淡竹叶、甘草共15味中药组成,主要功能为疏风解表、清热解毒、利咽止咳,主治感冒发热、咽喉肿痛、扁桃体发炎等上呼吸道感染,主要针对外感风热或温病初起导致的发热、微恶风、头痛、口渴、咽喉充血痛疼、乳蛾肿痛等现代之风热型急性上呼吸道感染。该制剂于1991年取得“医院制剂批文”,开始在我院生产和使用,在临床应用期间疗效显著,安全性高,经济效益好,欲将其开发成中药6类新药。前期研究结果初步显示,金翘热毒清颗粒循常规合煎工艺(12、8、8倍水煎煮三次,时间分别为1.5、1、1小时),君药金银花、连翘的有效成分绿原酸和连翘酯苷A提取率较低。要实现处方中有效成分的提取分离,同时保证工艺的稳定可重复性,是目前面临的关键技术问题。因此,有必要对金翘热毒清颗粒的提取工艺作进一步的探讨研究。首先,绿原酸和连翘酯苷A皆属热敏成分,在高温条件下不稳定,主要由于绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯,其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分；连翘酯苷A为苯乙醇咖啡酸类化合物,分子结构中具有酯键和糖苷键,高温时易分解产生咖啡酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖和一次级苷。其次,钩藤的主要有效成分是生物碱,如：钩藤碱、异钩藤碱等,复方合煎时金翘热毒清中钩藤生物碱可能影响绿原酸的提取,降低绿原酸保留率。目前,常用的提取方法(如回流提取法、索氏提取法、冷浸提取法、渗漉提取法、水蒸气蒸馏法等)仍存在损失大,能耗高,溶剂消耗大,周期长,工序多,提取率低,有效成分提取不明确等问题。因此,在不降低有效成分生理活性的基础上,力求寻找一种快速、高效提取出活性高、质量稳定的有效成分的方法。而超高压提取技术则是最近几年才出现的一种全新的低温提取技术,其工作原理是先将药材粉碎与提取介质混合放入密闭容器中,迅速升高压力至100MPa以上,保压1-10min,快速卸压。在超高压提取过程中,由于压力较高,大大加快了浸润过程和溶质扩散过程,使药材毛细孔内快速充满溶剂,提高了有效成分的传质速度。其特点是提取时间短,提取效率高,能耗低(一次性加压、一次性添加溶剂即可),杂质含量少,提取工艺简单,无环境污染,且机械化程度高,特别适用于热敏成分的提取研究。因此,本研究拟针对金翘热毒清合煎工艺时绿原酸和连翘酯苷A提取率低的情况,首先探讨绿原酸、连翘酯苷A提取率低的原因,并应用常温超高压提取技术提高绿原酸、连翘酯苷A的提取率,探讨解决金翘热毒清提取工艺存在的问题,为进一步的实验研究提供基础。目的：探讨金翘热毒清中绿原酸、连翘酯苷A提取率低的原因,并应用超高压技术提高绿原酸和连翘酯苷A的提取率,探讨解决金翘热毒清提取工艺中存在的问题。方法：1、探讨绿原酸、连翘酯苷A提取率低的原因(1)考察煎煮温度对绿原酸、连翘酯苷A提取率的影响,分别以绿原酸、连翘酯苷A的含量为指标,采用HPLC测定金银花药材温浸液和煎煮液、以及连翘药材温浸液和煎煮液中的含量；(2)考察pH、煎煮时间、钩藤合煎对绿原酸含量的影响,测定金银花单煎液、钩藤单煎液、以及金银花和钩藤合煎液中绿原酸的含量并进行比较；(3)考察钩藤碱对照品对绿原酸含量的影响,测定绿原酸对照品单煎、绿原酸对照品和钩藤碱对照品合煎后的绿原酸的含量。最后,采用SPSS13.0软件对测定结果进行分析。2、应用超高压技术分别提取绿原酸、连翘酯苷A的工艺研究在单因素试验的基础上,采用三因素三水平Box-Behnken实验设计分别对金银花中绿原酸、连翘中连翘酯苷A的超高压提取工艺参数进行优选。分别以绿原酸、连翘酯苷A提取率为指标,考察浸泡时间、液固比、提取压力、提取时间等因素对提取工艺的影响。优选超高压提取法提取金银花中绿原酸、连翘’中连翘酯苷A的最佳工艺,并与回流提取、超声提取和水煎煮法进行比较。3、优化超高压提取金翘热毒清的最佳工艺研究采用Box-Behnken效应面法,优选金翘热毒清中绿原酸和连翘酯苷A的超高压提取工艺条件,并与回流和水煎煮法进行比较。在单因素试验的基础上,采用三因素三水平Box-Behnken实验设计对金翘热毒清颗粒的超高压提取工艺参数进行优选。以溶剂倍量、提取压力、提取时间为自变量,以绿原酸、连翘酯苷A2种成分含量为因变量,采用Hassan方法计算总评“归一值”,并用多元线性回归及二项式拟合,建立总评归一值与自变量之间的数学关系,经效应面法预测最佳工艺条件。结果：1、金银花药材、连翘药材100℃煎煮时,HPLC色谱图结果显示绿原酸前后均出现一新的色谱峰,连翘酯苷A前亦出现一新的色谱峰,说明绿原酸、连翘酯苷A高温受热不稳定,或存在降解的情况,降低绿原酸、连翘酯苷A的提取率；且金银花煎煮时间越长,绿原酸越易降解,含量越低。而在pH3.0的提取溶剂中,煎液中绿原酸的提取率较高,且与其他的pH提取溶剂的组别相比,均有统计学差异(P<0.05)。当钩藤金银花合并煎煮时间为1h时,钩藤并不影响绿原酸的提取,反而有促进绿原酸溶出的趋势；但是,当煎煮时间超过1h时,钩藤影响绿原酸的提取,降低绿原酸的提取率。然而钩藤碱对照品并不影响绿原酸的含量,故尚不能推断钩藤中钩藤生物碱影响绿原酸的提取。2、超高压提取金银花中绿原酸的最佳工艺条件为液固比75mL·g-1、压力100MPa、提取时间28s,此提取条件下绿原酸的提取率为25.43mg·g-1,高出回流提取11.35%、超声提取12.16%和水煎煮15.98%；绿原酸的提取率分别为25.2937,25.6423,25.4527mg·g-1,显示验证试验结果与预测结果接近。而超高压提取连翘中连翘酯苷A的最佳工艺条件为液固比70mL·g-1、压力151MPa、提取时间114s,此提取条件下连翘酯苷A的提取率为13.15mg·g-1,高出回流提取8.64%、超声提取6.52%和水煎煮10.43%；连翘酯苷A的提取率分别为13.1351,13.1367,13.1817mg·g-1,亦显示验证试验结果与预测结果接近。3、超高压提取金翘热毒清的最佳提取工艺条件是24倍量水,提取一次,提取压力112.1MPa,提取时间38s。从回归系数的显著性检验可知：模型中X1,X2,X3,X12均具有显著性差异,其他项不显著。总评归一值OD的实验值与预测值平均偏差为5.27%,二项拟合复相关系数R2=0.9878,说明设计模型拟合程度良好,可以用此模型对绿原酸和连翘酯苷A的提取率进行分析和预测。与回流、水煎煮法比较,超高压提取的绿原酸和连翘酯苷A含量均有显著性差异(P<0.05or P<0.01)。结论：采用现行的提取工艺提取金翘热毒清时,发现绿原酸和连翘酯苷A的提取率较低。结果显示,100℃高温、长时间煎煮导致了绿原酸、连翘酯苷A受热不稳定,易发生降解；在pH3.0的提取溶剂中,煎液中绿原酸的提取率较高；而当金银花与钩藤合并煎煮超过1h时,钩藤可致绿原酸提取率下降；但是,钩藤碱不影响绿原酸的含量,故尚不能推断钩藤中钩藤生物碱影响绿原酸的提取。所以,绿原酸的提取主要受煎煮温度、时间、pH、钩藤合煎等影响,而连翘酯苷A则主要受煎煮温度的影响。进一步采用超高压技术优化金翘热毒清工艺时,提高了绿原酸和连翘酯苷A的提取率,与常规回流、水煎煮法比较均具有显著性差异,为解决金翘热毒清提取工艺存在的问题提供思路。