背景：胃癌(Gastric Carcinoma, GC)是人类常见的恶性肿瘤之一,在我国居恶性肿瘤之首。近年来,随着诊断技术的进步及针对肿瘤的外科手术和放化疗治疗策略的成熟,胃癌的整体5年生存率有所提高,但术后胃癌的复发率仍居高不下,预后效果并不令人十分满意。目前,大量的研究结果证实胃癌的发生、发展和预后是多基因、多因素及多阶段改变的结果。所以研究胃癌相关基因及其蛋白分子不仅在了解胃癌的发病机制方面十分重要,而且在临床靶向性治疗和改善预后等方面也意义重大。肿瘤细胞无限制的增殖多与细胞周期密切相关。细胞周期(cell cycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程,一般可分为：G0期(静息期)、G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有丝分裂期)；包含两个主要检验点,即G1/S检验点(DNA合成起始转换点)和G2/M检验点(有丝分裂诱导转换点),通过检验点后,即使刺激信号被去除,细胞仍然会开始DNA复制。细胞周期是多阶段、多因子参与的精确而有序的调控过程,可分为外源性和内源性调控。外源性调控主要是由外界理化刺激引起；而内源性调控主要是通过对细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase, CDKs)、细胞周期依赖性激酶抑制因子(CDK inhibitors,CKIs)三者的调控来实现。众所周知,恶性肿瘤的明显特点为细胞凋亡障碍和增殖失控,大量的研究表明细胞周期的失控与肿瘤的发生、发展有着密切关系。所以研究肿瘤中细胞周期相关分子的变化有助于揭示肿瘤发生发展的机制以及对临床治疗具有指导意义。人RN181基因,又名HSPC238、RNF181(ring finger protein181),全长716个碱基,编码153个氨基酸,因其第40至60氨基酸残基能够形成特殊的RING指结构域而得名。2008年Brophy等首次证实RN181具有E3酶活性。本实验室前期研究首次证实RN181可以通过ERK/MAPK途径抑制肝癌细胞HepG2、SMMC7721的生长。然而对于RN181在其它肿瘤中的作用,以及调节肿瘤的具体作用机制仍是知之甚少。酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)是一种直接用于检测细胞内蛋-蛋白相互作用的具有高灵敏度且通用的实验室方法,利用酵母体内特殊的GAL4转录调控因子,把待检测存在相互作用的两个蛋白质(X,Y)的编码基因分别与GAL4的DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(transcription activation domain,AD)融合,通过下游报告基因的的筛选,得到存在相互作用的蛋白分子。所以,本实验以临床上高发的胃癌为研究对象,通过细胞学实验、分子生物学实验、酵母双杂交等现代常用实验技术,对RN181在胃癌中的生物学功能以及在细胞周期方面的调节作用和具体机制进行研究。目的：1明确RN181在临床胃癌组织中的表达情况及其与胃癌发生发展的关系。2明确RN181在胃癌细胞生长方面的具体生物学作用。3在体内外阐明RN181对胃癌细胞周期的影响及相关机制。4通过酵母双杂交实验寻找与RN181直接相互作用并参与细胞周期调节的分子。方法：1采用免疫组织化学染色的方法在165例临床胃腺癌组织中,分析RN181的表达量与临床胃癌发生、发展的关系。2基于基因克隆技术,将pcDAN3.1(-)-flag/RN181中的RN181片段亚克隆到逆转录病毒包装质粒plncx2-GFP-IRES中,经酶切、测序和Western blot鉴定正确无误后,与pVSV-G共转染至GP2-293细胞中进行病毒包装。将包装的高表达逆转录病毒感染胃癌AGS细胞,而后经低浓度G418初步筛选；同时将购买的RN181(上海吉玛公司提供)干扰慢病毒感染胃癌AGS、MKN28和MKN45三种细胞,经流式分选得到带绿色荧光的稳定细胞系,通过RT-PCR、Western blot鉴定后,扩大培养、冻存。3CCK-8法检测稳定高表达RN181和稳定干扰RN18的重组细胞的增殖状况,同时用平板克隆形成实验检测重组细胞的体外克隆形成能力,用裸鼠皮下接种成瘤的方法观察重组细胞在裸鼠体内的成瘤能力。4采用细胞周期阻断释放法评价RN181在AGS细胞中对细胞周期的影响,同时用Western blot检测周期蛋白Cyclin D1, Cyclin A, Cyclin B相应的变化。5Western blot分析重组细胞在G1/S和G2/M两个周期检验点相关调节分子的变化,并用免疫组化的方法在裸鼠瘤体中分析上述细胞周期相关蛋白的表达。6通过酵母双杂交技术和DNA测序技术分析与RN181直接作用的蛋白分子,选取目的研究分子RPS27A,通过基因克隆技术构建pCMV-myc/RPS27A真核表达载体,经酶切、测序、western blot验证后,与pcDAN3.1(-)-flag/RN181共转染AGS细胞后,在加入或者不加入蛋白酶体抑制剂MG132的情况下,分析蛋白表达变化,同时经过细胞免疫荧光染色后进行共聚焦共定位初步分析RN181与RPS27A之间的相互作用。最后通过Co-IP证实RN181与RPS27A二者之间的直接相互作用。结果：1在182例临床标本中,通过免疫组化染色显示,RN181低表达于胃癌组织而高表达于相应癌旁组织。在癌旁组织中,RN181的表达无年龄、性别、病理分级、临床分期和肿瘤大小的差异。在癌组织中,RN181的表达量在性别、病理分级、临床分期和不同大小的肿瘤中均具有显著差异,具体为男性胃癌患者的RN181表达量低于女性；随着分化程度降低,RN181表达量逐渐降低；随着胃癌进入中晚期,RN181的表达量也呈梯度下降；另外胃癌肿瘤越大,RN181的表达量越低。在生存期分析中癌组织中低表达RN181的病人,中位生存时间和5年生存率均显著低于RN181表达较高的胃癌病人。2逆转录病毒包装载体plncx2-GFP-IRES/RN181经酶切、测序和Westernblot鉴定构建成功,并与pVSV-G在GP2-293细胞中包装得到了高表达RN181的逆转录病毒。该病毒感染的AGS细胞经低浓度G418筛选后和RN181干扰慢病毒感染的AGS、MKN28和MKN45细胞,经流式分选得到了稳定的重组细胞。重组细胞经RT-PCR和Western blot实验从mRNA和蛋白水平均证实构建成功。3CCK-8实验中高表达RN181的AGS重组细胞(AGS-RN181),体外生长速度明显慢于对照细胞(AGS-RV),而干扰RNl81后的AGS、MKN28和MKN45重组细胞的体外生长则显著快于其各自的对照细胞。平板克隆实验显示AGS-RN181重组细胞的克隆生长速度慢于对照细胞,形成的克隆大小也小于对照细胞,差异具有统计意义；干扰RN181后的AGSMKN28和MKN45重组细胞则对克隆形成有明显的促进作用。裸鼠皮下成瘤实验显示高表达RN181的AGS重组细胞(AGS-RN181)的皮下移植瘤生长慢于对照细胞(AGS-RV),而干扰RN181的AGS重组细胞(AGS-KD)的皮下移植瘤生长则明显快于对照细胞(AGS-NC)。4周期阻断释放试验显示高表达RN181抑制AGS细胞由G1期到S期的进程,干扰RN181后该现象得到缓解；另外干扰RN181后可能加快了AGS细胞由G2期进入M期的进程；Western blot结果显示周期蛋白Cyclin D1, CyclinB的变化与上述现象相一致。5Western blot分析细胞周期G1/S和G2/M两个检验点的调节分子表达差异发现RN181对AGS细胞周期的抑制作用主要发生在G1/S检验点,在RN181高表达时Cyclin D, CDK4分子表达量降低,抑癌因子P21上调；干扰RN181后上述分子变化正好相反。在裸鼠的移植瘤中,通过免疫组织化学染色证实Cyclin D, CDK4和P21三种分子的变化与体外重组AGS细胞中变化一致。6通过酵母双杂交实验,初步筛出了41个与RN181有相互作用的分子,其中大多分子主要参与了细胞凋亡、周期、代谢、粘附等相关生物学作用。pCMV-myc/RPS27A真核表达载体,经酶切、测序、western blot证实构建成功。在共转染实验中,RPS27A在于RN181共表达于AGS细胞时表达量明显下降,且这种下调不受MG132的影响。在AGS细胞中共定位实验也显示二者在AGS细胞中有空间上的重叠,Co-IP实验证实了二者之间的直接相互作用。结论：在临床胃癌组织中,RN181低表达于癌组织而高表达于相应癌旁组织,且与胃癌的分化程度、生存时间呈正相关,与临床分期和肿瘤大小呈负相关；RN181在癌旁组织中的表达不存在明显的性别、年龄、病理分级、临床分期和病理分级的差异,提示RN181可能是一个新的胃癌抑制分子。通过基因克隆技术、逆转录病毒包装技术和流式分选技术,我们成功构建了稳定高表达RN181的AGS重组细胞系和稳定干扰RN181的AGS、MKN28和MKN45重组细胞系。通过CCK-8实验和平板克隆形成实验证实高表达RN181抑制AGS细胞体外的生长,而干扰RN181后则促进AGS、MKN28和MKN45细胞的体外生长。裸鼠皮下成瘤实验显示高表达RN181抑制AGS细胞的成瘤效果,而RN181干扰后可逆转该现象。高表达RN181可以抑制AGS细胞由G1期到S期的进程,干扰RN181后该现象得到缓解；另外干扰RN181后可能加快了AGS细胞由G2期进入M期的进程。RN181对AGS细胞周期的抑制作用主要发生在G1/S检验点,其分子机制是下调Cyclin D, CDK4分子的表达和上调抑癌因子P21的表达。在裸鼠的移植瘤中,Cyclin D, CDK4和P21这三种分子的变化与在AGS重组细胞中的变化一致。通过酵母双杂交实验,共得到了41个与RN181有相互作用的分子,其中参与细胞周期调节的RPS27A分子经共转染分析、荧光共聚焦共定位技术和Co-IP实验得到了证实。RPS27A参与细胞周期调节的具体机制仍在进一步的研究中。