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背景和目的:Crispr(Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats)称为规律成簇的间隔短回文重复序列,最初发现于多种古生物与细菌基因组中,被认为与其免疫系统相关。随着研究的深入,人们发现Crispr可用于基因工程,并将其开发成为一种强大的基因编辑技术。与早些年兴起的基因编辑技术锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)相比,Crispr/Cas9系统操作更简单,所需时间少,编辑效率高且成本更低,因此近年来逐渐成为主流的基因编辑技术。在本文中,我们采用Crispr/Cas9系统在工程细胞株中华仓鼠卵巢细胞(CHO)和人胚胎肾细胞(HEK293T)中进行靶向的基因编辑,并取得了成功。目前市场上有一半以上的治疗用重组蛋白药物都是通过哺乳动物细胞表达系统进行生产,但哺乳动物细胞株存在不稳定性,随着培养时间的延长,有的细胞株产量会显著降低。研究表明这种不稳定性有可能和细胞的表观遗传学修饰有关,特别是DNA的甲基化。目前在哺乳动物细胞中,已发现有三种控制DNA甲基化的酶,我们选择了其中一种,即DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)进行研究,通过Crispr/Cas9技术将控制此酶表达的基因敲除,并初步研究了该基因被敲除后细胞株的生长特性及外源蛋白的表达情况。另一方面,目前构建重组细胞株的方法主要是随机整合的方式,而这种随机整合的细胞株由于无法控制目的基因在基因组中插入的位置,会造成称之为“位置效应”的问题,为克服此种情况的发生,学者纷纷转向在基因组中定点整合目的基因。由于Crispr/Cas9技术的独特优势,有很多研究开始尝试利用其进行细胞基因组中目的基因的定点插入。在本文中,我们就利用Crispr技术在CHO细胞的岩藻糖转移酶(FUT8)基因座中定点插入了细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4Ig)基因。方法:在CHO细胞和HEK293T细胞中敲除DNMT3a基因:针对CHO细胞和HEK293T细胞DNMT3a蛋白的关键作用位点设计两对短向导RNA(sgRNA),构建成功后将两对sgRNA共转染到相应的细胞中,然后用有限稀释法在96孔板中铺单克隆并筛选到基因敲除的单克隆细胞株。用绿色荧光蛋白(GFP)作为模式蛋白来验证在DNMT3a基因敲除的细胞株中,外源蛋白的转染及表达与野生型细胞是否具有差异。在CHO细胞FUT8基因座中定点整合CTLA4Ig基因:在FUT8基因的起始密码子ATG附近设计五对sgRNA,然后挑选效率最高的两对sgRNA,将其连同构建的供体质粒共转染到CHO细胞,经过加药筛选后,用有限稀释法铺单克隆培养板,挑取单克隆并进行检测,成功得到CTLA4Ig基因定点整合的细胞株。结果:在CHO细胞和HEK293T细胞中敲除DNMT3a基因:最终通过有限稀释法筛选得到了一株DNMT3a基因完全敲除的CHO细胞株(后面简称DNMT3a-CHO)和一株DNMT3a基因完全敲除的HEK293T细胞株(后面简称DNMT3a-HEK293T)。应用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪(UMS)对细胞全基因组的胞嘧啶甲基化情况进行分析,结果表明相比于野生型CHO细胞(后面简称WT-CHO),DNMT3a-CHO细胞基因组甲基化胞嘧啶的含量降低了27%,而DNMT3a-HEK293T细胞基因组中甲基化的胞嘧啶含量要比野生型的HEK293T细胞(后面简称WT-HEK293T)降低了22%。在生长性质方面,DNMT3a-CHO和WT-CHO生长特性无显著差异,而DNMT3a-HEK293T较WT-HEK293T倍增时间延长。应用GFP作为模式蛋白验证在DNMT3a基因敲除的细胞株中,外源蛋白的产量是否得到了提高,结果表明在CHO细胞中,敲除DNMT3a基因对GFP的表达量没有显著影响,而在HEK293T细胞中,敲除DNMT3a基因则会显著减少GFP的单位表达量。在CHO细胞FUT8基因座中定点整合CTLA4Ig基因:所设计的5条sgRNA编辑效率从17.7%到31.7%不等,在ATG的上下游分别选择了一条效率最高的sgRNA进行下一步的实验。通过对转染了sgRNA和供体质粒的CHO细胞进行加药筛选,最终我们获得了56株单克隆细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)和蛋白印迹(Western Blot)检测,我们从56株单克隆细胞株中挑选出了19株成功定点整合的细胞,阳性率达到了33.9%。