miRNA在不同侵袭性甲状腺乳头状癌组织中的差异表达及其意义　　目的　　甲状腺癌是发病率上升最快的内分泌系统实体恶性肿瘤。其中甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)为最常见的病理类型，占甲状腺恶性肿瘤的90％左右。PTC大多预后良好，但仍有部分PTC表现为侵袭性生物学行为，可造成临近组织器官受累，如:腺外侵犯严重、早期淋巴结转移等，明显降低了手术切除率，影响预后。明确可预测、判定PTC的生物学行为的标志物至关重要。研究与PTC侵袭相关的分子生物学机制可用于评估PTC的侵袭性、指导手术范围，也可作为靶向治疗中的靶点来控制肿瘤的生物学行为。MicroRNA(miRNA)作为一种最常见的非编码RNA，不仅参与生物体生长发育等正常生理过程，还与机体多种病理过程密切相关，其表达异常在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。据报道，miRNA对胃癌、结肠癌、肺癌等肿瘤侵袭性的调控机制已有深入的研究，但miRNA调控PTC侵袭性的具体机制还有待进一步研究。为此，我们拟利用miRNA芯片及实时定量反转录PCR筛选不同侵袭特性的PTC组织中差异表达的miRNA，并分析其与临床资料的相关性。　　方法　　研究对象为我院普通外科2008年1月～2012年4月临床资料完整的91例PTC患者的手术切除标本，所有标本均于获取后立即置入液氮中速冻，之后转移至-80℃冰箱中保存。首先选取经病理证实的腺外侵袭PTC组织（EX组）及无腺外侵袭PTC组织(NE组)各3例，确保两组PTC病例在病程、临床分期、肿瘤大小等方面无显著性差异。应用miRNA芯片初步筛选差异基因。实时定量RT-PCR验证芯片结果:提取全部91例冻存组织的小RNA，加尾法逆转录成cDNA，扩增目的基因，检测侵袭组和非侵袭组中差异表达的miRNA。相关临床资料分析:探讨具有显著差异的miRNA与临床资料的相关性（包括:包膜及周围组织侵犯，淋巴结转移，TNM分期，肿瘤大小，多发与双侧癌，性别，年龄，生存率，复发情况等）。　　结果　　1.miRNA芯片结果显示:miR-32，miR-146b，miR-221，miR-222和miR-135b在EX组显著高表达;miR-663，miR-214*，miR-299-5p，和miR-939在EX组显著低表达;实时定量反转录PCR验证芯片结果:miR-146b，miR-221，miR-222和miR-135b在EX组显著高表达，与芯片结果一致;miR-663在EX组中显著低表达。　　2、差异表达的miRNA中，表达水平与性别（miR-222）、肿瘤TNM分期(miR-146b，miR-222)及大小(miR-146b，miR-222，miR-135b)相关。miR-663的表达水平与年龄和肿瘤大小相关。　　结论　　1、miR-146b，miR-221，miR-222和miR-135b在EX组中的表达水平显著高于NE组，其表达水平与性别(miR-222)、肿瘤TNM分期（miR-146b，miR-222）及大小(miR-146b，miR-222，miR-135b)相关　　2、miR-663在EX组中的表达水平显著低于NE组，其表达水平与年龄及肿瘤大小相关。miR-663的低表达可能会促进PTC的进展　　关键词:甲状腺癌;侵袭;miRNA;基因芯片;实时定量反转录PCR　　miR-663靶向TGFβ1基因调控细胞上皮间质转化影响PTC细胞侵袭性的分子机制研究　　目的　　PTC远期预后良好，10年相对生存率超过90％，但一些伴有侵袭表型（如腺外侵犯、浸润性生长，淋巴结转移或远处转移）肿瘤的患者预后较差。如何治疗这些患者将是我们努力研究的目标，其成果具有重要的临床意义。miRNA不仅参与生物体生长发育等正常生理过程，还与机体多种病理过程密切相关。据报道，miRNA对胃癌、结肠癌、肺癌等肿瘤侵袭性的调控机制已有深入的研究，但miRNA调控PTC侵袭性的机制尚不明确。论文一中筛选出的差异基因为我们研究PTC侵袭性的分子机制提供了新的途径。我们率先发现miR-663在高侵袭性的PTC组织中显著低表达，且差异倍数是最大的，说明miR-663的低表达可能会促进PTC的进展。结合文献报道，我们拟将miR-663作为进一步研究的对象，探讨其抑制PTC侵袭的分子生物学机制。　　方法　　应用PTC细胞株IHH4及BCPAP，构建过表达或低表达miR-663的PTC细胞株:参照吉玛公司的转染试剂siRNA-Mate的说明书，分别将miRNAmimic、miRNAmimicnegativecontrol、miRNAinhibitor、miRNAinhibitornegativecontrol（均由上海吉玛公司合成）瞬时转染PTC细胞株。Transwell细胞迁移及侵袭实验、划痕实验，检测过表达或低表达miR-663后，细胞迁移及侵袭生物学特性的改变。生物信息学方法筛选目标靶基因，靶标基因预测软件包括TargetScan、PicTar、miRanda。实时定量反转录PCR、Western-blot及ELISA检测细胞和组织中靶基因mRNA以及细胞中和细胞外靶基因蛋白及下游通路蛋白的表达水平。应用SPSS16.0软件处理和分析数据。每个实验重复3次，数据以mean±SD表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。　　结果　　1、Transwell迁移及划痕实验证实过表达miR-663抑制PTC细胞的迁移能力，而miR-663低表达则促进细胞迁移;Transwell侵袭实验证实过表达miR-663抑制PTC细胞的侵袭能力，而miR-663低表达则促进细胞侵袭;　　2、生物信息学软件预测TGFβ1为miR-663的靶基因，过表达miR-663可以抑制TGFβ1mRNA及蛋白的表达水平，低表达miR-663则作用相反;组织中TGFβ1的mRNA表达水平与miR-663表达水平负相关;　　3、沉默TGFβ1与过表达miR-663对细胞侵袭的抑制作用相似，沉默TGFβ1部分逆转miR-663抑制剂对细胞侵袭的促进作用，说明miR-663对细胞侵袭性的抑制可能是通过抑制TGFβ1的表达来实现的;　　4、Westernblot实验证实过表达miR-663可以上调上皮表型标志物E-cadherin蛋白的表达，下调间质表型标志物N-cadherin及Vimentin蛋白的表达，说明miR-663抑制细胞发生上皮间质转化;miR-663的高表达可以抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达水平;　　5、miR-663的高表达可以上调Smad4蛋白的表达水平。　　结论　　1、miR-663可能通过调控其靶基因TGFβ1的表达水平影响PTC细胞上皮间质转化，进而抑制PTC细胞的迁移和侵袭过程，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9可能参与上述过程;　　2、miR-663抑制PTC细胞迁移和侵袭的过程可能通过TGFβ1-Smad通路。