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沙门氏菌是一类对人和畜禽健康构成极大危害的革兰氏阴性致病菌,其中鼠伤寒沙门菌的感染率居沙门菌感染的首位,在世界范围内是一种常见的食品污染源。据调查,在引起机体肠炎的沙门氏菌中,鼠伤寒沙门氏菌占主要部分,且感染、发病率呈明显增高趋势。鼠伤寒沙门菌作为兼性胞内菌,能够在宿主单核吞噬细胞系统内生长、繁殖并随之迁移,避免抗体作用,而形成的SCV小泡也为细菌提供了一个安全稳定的寄生环境,这确保沙门氏菌能在机体持续存在。目前,细菌EF-Tu蛋白已被证实具有多种生物学功能,在多种菌属中均具有诱导宿主免疫应答的能力。提出假设:在鼠伤寒沙门菌感染宿主过程中,EF-Tu有可能作为一种重要的免疫原被宿主细胞所识别和捕获,在细菌与宿主细胞之间发挥作用。鼠伤寒沙门菌对小鼠的致病机理以及机体对鼠伤寒沙门菌的防御机制了解较多,而在人体内、体外研究较少,为进一步了解鼠伤寒沙门菌对人体的致病机制,本研究将鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白作为“诱饵”,人单核吞噬细胞(THP-1)作为宿主,运用GST-pull down方法筛选出与EF-Tu相关联的细胞蛋白,并进行验证,以开展沙门氏菌—宿主细胞相互作用的研究,为阐明沙门氏菌致病分子机制提供依据。实验由以下部分构成:1.原核表达EF-Tu蛋白以鼠伤寒沙门菌基因组为模板扩增tufA基因片段,完成原核表达载体的构建。将重组质粒pGEX-6p-1-tufA和pET30a-tufA转入E.coli中,1mM IPTG诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot进行检验。结果显示原核表达蛋白GST-EF-Tu和His-EF-Tu与理论值相近。2.EF-Tu蛋白单克隆抗体制备原核蛋白His-EF-Tu免疫BALB/c小鼠后,当抗体效价达到单克隆抗体制备的标准,通过细胞融合、间接ELISA筛选、5次亚克隆获得5组稳定分泌单克隆抗体的阳鼠伤寒沙门氏菌翻译延伸因子ef-tu蛋白与宿主(thp-1)蛋白相互作用的筛选、验证和功能研究性杂交瘤细胞,再扩大培养收集细胞培养上清作为单克隆抗体,这5组单抗的亚型均为igg1/к。将免疫原蛋白his-ef-tu、鼠伤寒沙门氏菌菌体蛋白/大肠杆菌菌体蛋白、重组蛋白gst-ef-tu及金黄色葡萄球菌菌体蛋白(阴性对照)为样品进行western-blot分析,单克隆抗体作为一抗,在dab显色后分别得到了大小与理论值相符的条带,ef-tu单抗具有特异性。3.鼠伤寒沙门氏菌ef-tu的表面定位活化培养鼠伤寒沙门氏菌至对数期后,取少量菌液作待检样品。以ef-tumab/pcab为工具,依次完成间接免疫荧光实验、流式细胞仪分析和补体中和试验对ef-tu进行定位,结果发现ef-tu存在于鼠伤寒沙门氏菌菌体表面。4.筛选与ef-tu相互作用的宿主细胞蛋白制备新鲜的宿主细胞蛋白与纯化后的ef-tu蛋白共孵育,设立对照组。将孵育后的产物用pbs(ph7.4)轻柔洗涤,除去杂蛋白后,从gstresin上洗脱,获得蛋白复合物。为观察是否存在与ef-tu蛋白相互作用的宿主细胞细胞蛋白,将蛋白复合物进行sds-page电泳,考马斯亮蓝染色,甲醇脱色。结果发现凝胶中多出两条蛋白条带。将凝胶中的蛋白质样品送去公司进行质谱测序,反馈信息得到两个蛋白,即pkm2和eef1α1。5.验证ef-tu与两种细胞蛋白存在相互作用提取宿主细胞rna,反转录为cdna作为模板,扩增pkm2和eef1α1基因片段,构建宿主细胞原核表达载体pet28a-pkm2、pet30a-eef1α1。将重组质粒分别转入e.coli中进行原核表达,验证表达成功后,大量表达并用ni柱进行his-pkm2和his-eef1α1蛋白的纯化。将新鲜的ef-tu蛋白分别与纯化后的his-pkm2和his-eef1α1共孵育,设立对照组。将孵育后的产物洗涤,除去杂蛋白后,从ni柱上洗脱,获得蛋白复合物进行westernblot分析。结果发现:dab显色后,pvdf膜上显出特异性条带,而对照组呈阴性反应。随后构建真核表达载体pdsred1-n1-tufa,并转染hela细胞,以ifa检测显示:ef-tu蛋白在细胞内成功表达。设立两个转染组,完成后对山东农业大学硕士学位论文Hela细胞内的pkM2、eEF1α1蛋白分别进行荧光染色,于激光共聚焦显微镜观察。结果表明,EF-Tu蛋白与pkM2、eEF1α1蛋白分别共定位在细胞质,这在空间上为两者发生联系提供佐证。6.鼠伤寒沙门菌侵染宿主细胞对pkM2和eEF1α1表达量的影响以1:100的比例将鼠伤寒沙门菌接种到细胞板,与宿主细胞共培养,使鼠伤寒沙门菌侵染宿主。在不同时间段取出细胞样品,以GADPH为参照,进行荧光定量检测。结果发现随着鼠伤寒沙门菌侵染细胞的时间增加,pkM2和eEF1α1的表达量减少。