翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)隶属于鲈形目(Perciformes)、鳜亚科(Sinipercinae)、鳜属(Siniperca),俗称桂鱼、桂花鱼、胖鳜、季花鱼等,是一种淡水底栖的肉食性名贵经济鱼类。它具有体型大、生长快、味道鲜美等特点,是我国重要的淡水养殖鱼类。但是近年来翘嘴鳜的各种疾病频繁暴发,其中,以传染性脾肾坏死病为代表的病毒性疾病和以细菌性烂鳃病为代表的细菌性疾病带来的危害最为严重,给养殖户带来了巨大的经济损失,对其养殖产业的可持续发展造成了严峻的挑战。因此,挖掘并研究翘嘴鳜免疫系统中相关功能基因及其对病毒性和细菌性感染的生理响应十分必要。为此,本研究通过RACE技术首次对翘嘴鳜PKR(double-stranded RNA-activated protein kinase)基因进行克隆和生物信息学分析；利用geNorm与NormFinder对翘嘴鳜3种常用的荧光定量内参进行了稳定性分析；利用荧光定量PCR对POLY(I:C)与LPS刺激后的翘嘴鳜各组织中PKR及其相关免疫基因的表达应答进行了分析。以期为挖掘翘嘴鳜干扰素系统的相关基因,以及深入探究干扰素系统在抵抗病原入侵过程中的应答机制与作用机理奠定基础。1翘嘴鳜PKR基因的克隆与序列分析根据转录组测序获得的部分翘嘴鳜PKR cDNA片段设计引物,对其5’端和3’端分别进行RACE克隆,拼接后得到了翘嘴鳜PKR基因全长cDNA共2791bp,包含66bp的5’非编码区(5’-UTR)、编码698个氨基酸的2097bp的开放阅读框、628bp的3’非编码区(3’-UTR),具有明显的终止密码子TAA和PolyA尾巴。对翘嘴鳜PKR基因编码的氨基酸序列的保守结构域进行检索,发现了3段保守的双链RNA结合结构域和一段蛋白激酶结构域。利用DNAMAN和MEGA软件将所得PKR基因编码的氨基酸与几种鱼和哺乳动物的PKR分子分别进行比对和绘制分子进化树,使用ClustalW2进行同源性分析,发现其与大黄鱼(Larimichthys crocea)的相似度最高,达到了76%,而与哺乳类动物眼镜猴和野猪的同源性较低,分别为30%和31%。2翘嘴鳜3种内参基因的稳定性分析为了提高后续荧光定量PCR实验数据的可靠性,我们对翘嘴鳜三种最常用的内参基因18S rRNA,p-actin和GAPDH的稳定性进行了评估。提取健康翘嘴鳜肝脏、脾脏、体肾、肠、鳃、血液、脑、心脏、肌肉、皮肤共10个组织的总RNA,通过qRT-PCR技术测定了3种内参基因在不同组织中的表达,并结合Ct值通过3种内参筛选分析软件(geNorm,NormFinder,BestKeeper)对3种内参基因做出稳定性评价。之后又分别对3种内参基因在POLY(I:C)或LPS刺激后的翘嘴鳜各组织中的表达稳定性进行了分析。最后发现在健康翘嘴鳜10个组织中,3种内参基因的表达稳定性依次为18S rRNA>β-actin>GAPDH;在POLY(I:C)或LPS刺激后的翘嘴鳜各组织中,3种内参基因的表达稳定性依次为β-actin>18S rRNA> GAPDH。表明当研究正常翘嘴鳜不同组织中目的基因表达情况时,18S rRNA更适合作为荧光定量PCR实验的内参基因；而在研究POLY(I:C)或LPS刺激后的翘嘴鳜组织中目的基因表达情况时,使用β-actin作为荧光定量PCR实验的内参基因更可靠。3 POLY(I:C)或LPS刺激后翘嘴鳜各组织中PKR及干扰素系统相关基因的表达根据试验一所得翘嘴鳜PKR基因的cDNA序列,设计了适用于荧光定量PCR的特异性引物,并通过qRT-PCR对PKR及其他6种干扰素系统相关基因Mx、Viperin、IRF-1、IRF-2a、IRF-2b、IRF-7进行了荧光定量检测,分别测定了它们在正常组织中的分布情况与POLY(I:C)或LPS刺激后不同组织中的时序表达情况。实验发现,所研究的7种干扰素系统相关基因在各组织中均有不同程度的表达,但表达量最多的组织主要还是肝、脾、肠、鳃和血液。在POLY(I:C)或LPS刺激后,各基因在不同组织的表达应答情况都有不同,但较注射PBS缓冲液的对照组都有显著上调,说明了这些干扰素系统相关基因在抵抗病毒与细菌入侵的免疫反应中均有其各自的作用,且在不同组织不同刺激后的免疫应答模式可能存在差异。其中,实验数据表明Viperin在机体的抗病毒免疫过程中可能发挥着相当重要的作用,并有可能通过与PKR、Mx不同的诱导机制而率先被激活；Mx在肠中可能有着比其他几种基因更为重要的免疫功能；肝脾在抵抗病原入侵中或许具有不同的分工,或许肝脏主要负责抗病毒免疫而脾脏主要负责抵御细菌入侵。