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背景上海市肿瘤研究所1988年上海市市区恶性肿瘤发病率统计资料表明,除恶性黑色素瘤以外的皮肤恶性肿瘤发病率为1.53/10万。皮肤痛的病因尚未完全明了,其发生可能与过量的日光暴晒、放射线、砷剂、焦油等长期刺激有关。日光中的紫外线根据波长不同可分为短波紫外线UVC、中波紫外线UVB和长波紫外线UVA。它在穿过地球大气层时,其中全部的UVC和大约95%的UVB能够被有效吸收。随着工业化的发展,臭氧层空洞面积的不断增加导致大气对太阳辐射特别是UVB的吸收减少,使人体皮肤接受的UVB辐射增加,过量的UVB照射可以使皮肤出现红斑、炎症、老化甚至引起皮肤痛的发生。据统计,臭氧含量每减少1%,皮肤痛的发病率将增加2%～3%。这一系列的问题越来越引起了人们的关注。在皮肤肿瘤发生过程中,UVB诱导p53基因的突变被认为是的一个早期变化。P53可通过对其下游转录因子的调控来诱导细胞周期阻滞或启动细胞凋亡途径。但是这些研究大多数局限于调节蛋白编码基因层面,包括调节p53活性的上游作用基因(ATM、ATR、CHK2等)、下游作用基因(p21、GADD45、14-3-3sigma等)以及起反馈作用的基因(如：m2m)等,而对于非蛋白编码基因miRNA是否也参与到紫外线诱导细胞损伤机制中的报道较少。miRNA(或称microRNA)是一类分子量大约为22nt的内源性非编码单链小分子RNA,它广泛参与调节细胞周期、信号转导、细胞凋亡和增殖分化等生物学过程。近年来对miRNA的研究和报道不断涌现,但是这些主要是集中在对小部分miRNA的阐述,而对于大多数的miRNA知之甚少,仍然存在较大的研究空间。本实验室以往利用基因芯片技术比较分析了NIH3T3细胞在UVB照射前后miRNA表达谱的差异,结果显示：在受到50J/m2UVB照射后,细胞内数十种miRNA分子均出现了不同程度的表达变化。而在这些miRNA中,miR-365的变化显著,它在照后6h与对照组相比升高了6倍多。另外,我们用miRWalk (http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)和Targetscan (http://www.targetscan.org/)对miR-365进行靶基因预测,发现miR-365与p53调控的多个下游基因如bcl2, p21, p63, bax等都存在可能的结合位点。因此,我们利用p53差异表达的两株MEF细胞(即p53正常表达的MEF细胞和p53低表达的MEF细胞)来初步探讨UVB, p53和miR-365三者之间的关系。目的对miR-365是否参与UVB诱导的细胞生物学改变进程进行初步研究,观察细胞中p53和miR-365在UVB应激下的表达情况,探讨UVB应激下p53调控细胞周期阻滞过程中miR-365的作用。方法1.MTT检测细胞生存率MEF细胞接种于96孔板,每孔接种1000个。待细胞生长至对数增长期时用不同剂量(10J/m2、30J/m2、50J/m2、70J/m和100J/m2)的UVB照射MEF细胞,并继续培养24h后,MTT法检测细胞存活率；用50J/m2UVB照射MEF细胞后继续培养,在照后不同培养时间(2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h和48h)使用MTT法检测细胞存活率。两种处理均以未受照组作为对照。2.流式细胞术检测细胞周期分布分别于照前和照后6h、12h、18h、24h收集细胞并计数细胞数大于1×106个,用预冷的PBS洗涤细胞2次后加入预冷的70%乙醇,于4℃固定过夜。固定好的细胞用预冷的PBS洗涤2次,再用500μL PBS将细胞重悬后分别加入PI和RNases A至PI和RNases A的终浓度为50μg/μL,37℃避光孵育30min后用流式细胞仪进行检测。3. RT-PCR检测细胞p53mRNA的表达以50J/m2UVB照射细胞后继续培养,并于照后1h、2h、4h、6h、8h、12h和24h使用Trizol一步法提取总RNA,依据SYBR PrimerScript1TM RT-PCR Kit说明书进行逆转录和PCR反应。以照前作为对照组。4. Western blot检测细胞P53蛋白的表达以50J/m2UVB照射细胞后继续培养,并于照后1h、2h、4h、6h、8h、12h和24h用细胞裂解法提取总蛋白,进行western blot检测,以照前作为对照组。5. Realtime PCR检测细胞miR-365的表达以50J/m-UVB照射细胞后继续培养,并于照后2h、4h、6h、8h和12h使用Trizol一步法提取总RNA,按照All-in-One? miRNAqRT-PCR Detection Kit说明书进行逆转录和realtime PCR反应,以照前作为对照组。6.统计学分析采用SPSS13.0软件,结果以均数±标准差(X±S)表示,对于细胞株构建结果鉴定的两组均数比较采用t检验；多组均数比较采用单因素方差分析,各组均数间两两比较除了细胞生存率和周期分布数据采用SNK法外其余的采用Dunnett-t检验,双侧检验,取α=0.05为检验水准。结果1.细胞生存率的变化MEF细胞在受到不同剂量的UVB照射后,细胞生存率随着UVB照射剂量的增加而逐渐下降,各组细胞生存率之间存在统计学差异(F=109.755,P<0.001),而细胞在接受10J/m2、30J/m2、50J/m2、70J/m2UVB照射后其生存率变化显著(P<0.05),其中当细胞受到50J/m2UVB照射后其生存率为(64.48±3.44)%。细胞在接受50J/m2UVB照射,其生存率随着照后时间的延长逐渐下降,各组的生存率具有统计学差异(F=270.810,P<0.001),而在照射后的2h、6h、12h、24h和36h其生存率变化显著(P<0.05)。2.UVB照射前后两种细胞的周期分布情况结果显示p53正常表达的MEF细胞在受到UVB照射后各时间点细胞周期的分布存在统计学差异(F=7.374,P=0.005),在照后18h时发生了明显的S期阻滞(P<0.05),并且在照后24h出现一明显的凋亡峰；p53低表达的MEF细胞在UVB照后各时间点以及与对照组相比均未发现细胞周期分布有明显改变。3.UVB照射前后两种细胞的p53mRNA勺表达情况这两种细胞在UVB照射后各时间点p53mRNA的表达量与对照组比较,均未发现明显改变。4.UVB照射前后两种细胞的P53蛋白的表达情况UVB照射后p53正常表达的MEF细胞中P53蛋白的表达量在照后1h出现升高,并且随着照后时间的延长持续增加,照后12h达到峰值,到照后24h有所下降但仍高于对照组；p53低表达的MEF细胞中P53蛋白的表达量未见明显改变。5.50J/m2UVB照射前后两种细胞的miR-365的表达情况UVB照射后p53正常表达的MEF细胞中各时间点的miR-365的表达量具有统计学差异(F=8.343,P=0.001),与对照组相比在照后4h出现升高(P<0.05),并持续到照后8h,到照后12h时miR-365的表达量恢复到照前水平；p53低表达的MEF细胞中miR-365的表达量与对照组比较,未见明显改变。结论1.MEF细胞UVB照射后其生存率对UVB存在剂量依赖性和时间依赖性。2.P53蛋白在UVB诱导MEF细胞S期阻滞过程中可能发挥了调节作用。UVB诱导MEF细胞P53蛋白表达增加则是通过转录后机制来实现的。3.miR-365可能参与了p53的调节网络。细胞中P53的增加激活miR-365的表达,miR-365可能作用于细胞周期调节和细胞凋亡启动的关键步骤,从而引起细胞周期阻滞或细胞凋亡。