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目的：
基于“肾--髓--骨”理论及BMSCsWnt/β-catenin信号通路，探讨骨碎补对去卵巢大鼠的骨保护作用，主要包括促进骨形成及抑制骨吸收两个方面。
方法：
本实验分三部分，实验一：应用Micro-CT、骨组织切片，及对骨代谢指标TRAP、MMP-9、CTX-1的测定，观察骨碎补灌胃对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构、骨髓腔内脂肪组织及血清骨吸收指标的作用。实验二：利用Western-Blot、实时定量PCR技术观察骨碎补灌胃对BMSCsWnt/β-catenin信号通路相关因子Wnt3a、Wnt1、β-catenin、CyclinD、C-myc、lef1、PPAR-γ、C/EBP-α等作用，利用ALP染色及定量分析，茜素红钙结节染色及定量分析，油红染色及定量分析观察骨碎补灌胃对BMSCs成骨成脂分化的影响。实验三：建立BMSCs与OC共培养体系，对破骨细胞进行HE及TRAP染色，倒置相差显微镜观察破骨细胞的分化成熟情况并对破骨细胞进行计数。利用Western-Blot、实时定量PCR检测BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL及OC中TRAP等指标，利用ELISA检测共培养液中OPG、RANKL含量，观察骨碎补经BMSCs对破骨细胞分化成熟及活性的影响。
成果：
实验一：骨碎补灌胃可以提高去卵巢骨质疏松大鼠骨密度，改善骨微结构，减少髓腔内脂肪组织，降低血清骨吸收指标(TRAP、MMP-9、CTX-1)。实验二：骨碎补灌胃可以激活Wnt/β-catenin信号通路，提高信号通路上Wnt1、Wnt3a、β-catenin、C-myc、CyclinD基因表达，提高Wnt3a、Wnt1、β-catenin、lef1蛋白含量，降低成脂关键因子PPAR-γ基因表达及蛋白含量、降低C/EBP-α蛋白含量。成骨诱导下，骨碎补灌胃可以提高BMSCsALP染色及茜素红染色定量结果；成脂诱导下，降低其油红染色定量结果。实验三：破骨细胞形态学观察及计数显示：骨碎补灌胃可以抑制共培养系统中破骨细胞的数量及分化成熟程度，促进BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白含量及基因表达，抑制BMSCs中RANKL蛋白含量及基因表达，抑制破骨细胞中TRAP基因表达，ELISA结果显示骨碎补灌胃后促进培养液中OPG含量升高，抑制RANKL含量。
结论：
1.骨碎补具有明显骨保护作用。基于BMSCsWnt/β-catenin通路的相关研究显示：骨碎补可激活Wnt/β-catenin信号通路，调节β-catenin和PPAR-γ相互关系，调控BMSCs分化，促进成骨分化，抑制成脂分化，促进骨形成。同时骨碎补可能通过Wnt/β-catenin信号通路作用BMSCs，调节OPG及RANKL分泌，抑制破骨细胞OPG/RANKL/RANK通路，抑制破骨细胞的分化成熟及其活性，从而抑制骨吸收。通过促进骨形成、抑制骨吸收，最终达到重建骨平衡，发挥骨保护的作用。
2.根据中医“肾--髓--骨”理论体系，我们考虑可以将BMSCs与中医“髓”相联系，可将其认定为中医“髓”的细胞学基础。同时，我们进一步提出在中医“肾--髓--骨”理论体系下，可考虑将其中的“肾”或“肾精”与现代医学中调控BMSCs分化增值的各种信号通路如Wnt/β-catenin信号通路、BMP信号通路等相联系，或者至少将其认定为是“肾精”滋养“髓”的一种具体作用途径或机制，进一步丰富和发展中医“肾主骨生髓”、“补肾荣髓壮骨”理论。
基于“肾--髓--骨”理论及BMSCsWnt/β-catenin信号通路，探讨骨碎补对去卵巢大鼠的骨保护作用，主要包括促进骨形成及抑制骨吸收两个方面。
方法：
本实验分三部分，实验一：应用Micro-CT、骨组织切片，及对骨代谢指标TRAP、MMP-9、CTX-1的测定，观察骨碎补灌胃对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构、骨髓腔内脂肪组织及血清骨吸收指标的作用。实验二：利用Western-Blot、实时定量PCR技术观察骨碎补灌胃对BMSCsWnt/β-catenin信号通路相关因子Wnt3a、Wnt1、β-catenin、CyclinD、C-myc、lef1、PPAR-γ、C/EBP-α等作用，利用ALP染色及定量分析，茜素红钙结节染色及定量分析，油红染色及定量分析观察骨碎补灌胃对BMSCs成骨成脂分化的影响。实验三：建立BMSCs与OC共培养体系，对破骨细胞进行HE及TRAP染色，倒置相差显微镜观察破骨细胞的分化成熟情况并对破骨细胞进行计数。利用Western-Blot、实时定量PCR检测BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL及OC中TRAP等指标，利用ELISA检测共培养液中OPG、RANKL含量，观察骨碎补经BMSCs对破骨细胞分化成熟及活性的影响。
成果：
实验一：骨碎补灌胃可以提高去卵巢骨质疏松大鼠骨密度，改善骨微结构，减少髓腔内脂肪组织，降低血清骨吸收指标(TRAP、MMP-9、CTX-1)。实验二：骨碎补灌胃可以激活Wnt/β-catenin信号通路，提高信号通路上Wnt1、Wnt3a、β-catenin、C-myc、CyclinD基因表达，提高Wnt3a、Wnt1、β-catenin、lef1蛋白含量，降低成脂关键因子PPAR-γ基因表达及蛋白含量、降低C/EBP-α蛋白含量。成骨诱导下，骨碎补灌胃可以提高BMSCsALP染色及茜素红染色定量结果；成脂诱导下，降低其油红染色定量结果。实验三：破骨细胞形态学观察及计数显示：骨碎补灌胃可以抑制共培养系统中破骨细胞的数量及分化成熟程度，促进BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白含量及基因表达，抑制BMSCs中RANKL蛋白含量及基因表达，抑制破骨细胞中TRAP基因表达，ELISA结果显示骨碎补灌胃后促进培养液中OPG含量升高，抑制RANKL含量。
结论：
1.骨碎补具有明显骨保护作用。基于BMSCsWnt/β-catenin通路的相关研究显示：骨碎补可激活Wnt/β-catenin信号通路，调节β-catenin和PPAR-γ相互关系，调控BMSCs分化，促进成骨分化，抑制成脂分化，促进骨形成。同时骨碎补可能通过Wnt/β-catenin信号通路作用BMSCs，调节OPG及RANKL分泌，抑制破骨细胞OPG/RANKL/RANK通路，抑制破骨细胞的分化成熟及其活性，从而抑制骨吸收。通过促进骨形成、抑制骨吸收，最终达到重建骨平衡，发挥骨保护的作用。
2.根据中医“肾--髓--骨”理论体系，我们考虑可以将BMSCs与中医“髓”相联系，可将其认定为中医“髓”的细胞学基础。同时，我们进一步提出在中医“肾--髓--骨”理论体系下，可考虑将其中的“肾”或“肾精”与现代医学中调控BMSCs分化增值的各种信号通路如Wnt/β-catenin信号通路、BMP信号通路等相联系，或者至少将其认定为是“肾精”滋养“髓”的一种具体作用途径或机制，进一步丰富和发展中医“肾主骨生髓”、“补肾荣髓壮骨”理论。