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目的:遗传性凝血因子缺乏症是出血性疾病最常见的病因之一,临床表现主要为不同程度的出血倾向。目前除输注相应凝血因子进行替代治疗外,尚无成熟的治愈手段可用于临床。遗传性凝血因子缺乏症的主要发病机制是编码相应凝血因子的基因发生变异,导致凝血因子出现数量或功能的缺陷。常见遗传性凝血因子缺乏症包括血友病A、血友病B和血管性血友病,罕见遗传性凝血因子缺乏包括纤维蛋白原缺乏症、凝血因子II缺乏症、凝血因子V缺乏症、凝血因子VII缺乏症、凝血因子X缺乏症、凝血因子XI缺乏症及凝血因子XIII缺乏症等。在遗传性凝血因子缺乏症诊断方面,对于出血倾向严重且有明确家族史患者,常规凝血检测结合凝血因子测定一般可以明确诊断,但在表型较轻且无家族史者,常规检测明确诊断存在一定难度。分子诊断在区分表型、提供遗传学诊断等方面有一定优势,并可为临床出血患者的管理提供依据。本课题针对本地区凝血因子X（Factor X,FX）缺乏症和血友病A（hemophilia A,HA）、血友病B（hemophilia B,HB）进行分子诊断,以确认疾病表型,明确遗传学信息,并补充基因变异信息。探索新发现基因变异的致病机制,丰富和补充遗传性凝血因子缺乏症的变异谱和疾病谱。方法:1、遗传性FX缺乏症、HB和HA的表型诊断对于1例遗传性FX缺乏症患者及家系成员的诊断,使用一期法和酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测先证者及其家系成员的FX活性（Factor X activity,FX:C）和血浆中FX抗原（Factor X antigen,FX:Ag）含量。在针对HB32例患者及5个家庭的家系成员方面,使用一期法和ELISA法分别检测FIX活性（FactorⅨactivity,FIX:C）和FIX抗原（FactorⅨantigen,FIX:Ag）。使用Bethesda方法检测FIX抑制物。对53例HA患者进行FVIII活性（Factor VIII activity,FVIII:C）和血管性血友病因子（von Willebrand Factor,VWF）抗原（VWF antigen,VWF:Ag）含量测定。使用Bethesda方法检测FVIII抑制物。2、遗传性FX缺乏症、HB和HA的分子诊断遗传性FX缺乏症和HB的分子诊断使用PCR结合Sanger测序分析检测FX基因（F10）、FIX基因（F9）序列变异。测序结果经与数据库比对,除外SNP,确认F10和F9的序列变异。对于HA的分子诊断,首先使用LD-PCR和双管多重PCR检测内含子22倒位和内含子1倒位,对双倒位阴性者使用二代测序分析FVIII基因（F8）编码区序列变异及凝血因子相关的可能的基因变异。测序结果经基因注释分析及Sanger测序验证确认变异位点。3、新发现F10变异的致病机制研究通过构建过表达野生型FX基因载体和突变型FX基因载体,转染293T细胞,分析遗传性FX缺乏症变异对于蛋白质功能的影响。利用生物信息学分析工具进一步分析这些变异对于蛋白质结构和功能的影响。通过生物信息学预测HB和HA新发现变异的致病机制,剪接点变异通过剪接点变异在线预测工具Human Splice Finder version3.1（HSF,http://www.umd.be/HSF/）预测,以分析变异对于FIX的影响;使用SIFT和PolyPhen-2分析错义突变对FIX蛋白和FVIII蛋白结构及功能的破坏程度。使用i-Tasser软件对FIX蛋白结构同源建模,并使用PyMol对建模后的分子进行作图。使用Swiss-model软件和Swiss-Pdb Viewer工具对变异后FVIII蛋白进行同源建模并对建模后的分子进行展示作图。结果:1、凝血检测显示遗传性FX缺乏症先证者及其同样有出血症状的姐姐凝血时间显著延长,FX:C分别为3.2%和2.2%,FX:Ag分别为23%和11%。其父母的FX:C及FX:Ag水平约为有正常范围的50%,另一无出血症状的姐姐凝血指标均正常。根据表型诊断结果,先证者表型属于交叉反应物质阳性（CRM+）型。分子诊断结果表明先证者及有出血症状的姐姐携带有F10 p.Ser362Asn（c.1085G>A）纯合变异,父母均为此位点的杂合携带者,另一无出血症状的姐姐未携带基因变异。体外功能验证实验表明FX:C在突变型细胞培养基中显著下降,FX:Ag存在一定程度的下降,与患者表型一致。荧光定量PCR显示,此错义突变并未影响RNA的转录。生物信息学分析中,蛋白结构模拟提示变异位点与FX催化三联体（His276,Asp322和Ser419）空间位置较接近,可能影响FX蛋白与底物的结合。分子动力学模拟表明突变型蛋白与底物的结合能大于野生型蛋白与底物的结合能,说明突变型蛋白与底物结合稳定性弱于野生型蛋白。进一步分析野生型和突变型蛋白与底物类似物小分子的构象差异发现,此变异显著改变了关键催化残基His276（His42）的侧链构象。2、在32例HB患者中共检出23种变异,其中18种为F9变异数据库中已收录的变异,5种为本研究新发现的F9变异。新发现F9变异包括c.277+5 G>T,c.723+1G>A,c.839-6c.839-5 ins,c.553557 del CAAAC（p.Gln185Phefs*1）和and c.1215T>G（p.Asp405Glu）。剪接点变异c.277+5 G>T和c.723+1G>A主要是破坏了正常剪接位点的识别;大片段插入c.839-6c.839-5 ins因位于剪接点附近,破坏正确的剪接位点并形成多个异常的剪接点;小片段缺失p.Gln185Phefs*1主要是由于移码效应生成了截短的无功能的FIX蛋白;错义突变p.Asp405Glu位于F9催化区,对FIX蛋白的结构与功能产生了一定的影响。3、在53例HA样本中,共检出F8变异49例。其中内含子22倒位31例,内含子1倒位3例,其它变异类型15例,包括错义突变9例,移码突变4例（缺失2例,插入1例,单碱基复制1例）,无义突变2例。除了单碱基G复制变异（p.Ile1213Asnfs*28）为课题组前期报道的本地区热点突变,其余变异均为本地区首次发现。错义突变p.Cys172Ser,p.Tyr404Ser,p.Asp1903Gly,p.Ser2284Asn及缺失p.Leu2249fs*9和插入p.Pro2319fs*97为新发现的F8变异。F8变异中,错义突变p.Cys172Ser是由于Cys172处于A1结构域中高度保守的二硫键结构中,被其他氨基酸取代后会丢失原先的蛋白结构,导致重型HA;错义突变p.Asp1903Gly在一定程度上影响了FVIII蛋白的A3结构域的正确构象,进而影响了FVIII与VWF的结合,从而导致FVIII蛋白功能障碍,活性降低。错义突变p.Ser2284Asn对FVIII蛋白的影响是变异后Asn2284周围氢键增多,极性增强,蛋白结构的稳定性降低。错义突变p.Tyr404Ser的蛋白结构提示Ser取代Tyr后,氨基酸残基的构象发生了较大的改变,氢键减少,疏水性增强。移码突变p.Leu2249fs*9是由于在25号外显子中存在一个单碱基G缺失,导致氨基酸移码,提前终止,丢失了整个26号外显子编码的功能域。小插入突变p.Pro2319fs*97则是由于移码效应,使FVIII蛋白的翻译过程没有正常终止,使FVIII蛋白结构发生了较大的改变。结论:1、位于F10催化区的错义突变p.Ser362Asn是一个国内外首次报道的基因变异,通过细胞实验及分子生物学分析明确了此变异的致病机制为通过改变关键催化残基His276的侧链构象,影响了FX蛋白与底物结合,进而破坏了FX蛋白的正常活化。2、本地区的F9变异呈一定的异质性。错义突变是最常见的变异类型,主要发生于F9催化区。新发现的5种F9变异为c.277+5G>T,c.723+1G>A,c.839-6c.839-5ins,p.Gln185Phefs*1和p.Asp405Glu,经蛋白功能分析均为致病变异。3、对本地区F8的变异研究发现其存在较大的异质性,NGS分子诊断的应用充实了HA的变异谱,对后期的个体化遗传咨询及临床诊疗的评估有重要意义。NGS结合多种生物信息学预测方法,可进一步分析基因变异对蛋白结构及功能的影响,