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人Dok5(dockingprotein5)全长cDNA由本室于1998年从人胎脑cDNA文库中分离克隆(提交Genebank,接收号为NM_018431)。本室前期对Dok5的表达谱分析表明:Dok5在神经系统、骨骼肌和心肌中高表达,提示其在神经系统和肌肉系统发挥相应的功能。
P19CL6细胞是小鼠胚胎性癌细胞P19衍生的细胞系,用含1%DMSO的培养基培养时,该细胞能高效的分化成搏动的心肌细胞:心肌特异性的转录因子如Nkx2-5、GATA-4和MEF2C表达上调,10天左右就可以观察到肌小节肌球蛋白重链的表达,P19CL6细胞是体外研究心肌细胞分化的良好模型。
为解决上述问题,我们首先将Dok5上游启动子区构建到荧光报告基因的质粒pGL3basic中,并构建了一系列5’端缺失体,结果发现包含Foxo3a结合元件(Forkheadbindingelement,FHBE)的-300至-240之间的序列明显的抑制报告基因的表达;对该区域的FHBE进行突变,这种抑制作用就明显减弱,提示FHBE很可能是存在于Dok5启动子区中的负调控元件;电泳迁移率变动分析法(EMSAElectrophoreticmobilityshiftassay)证实核中分布的Foxo3a可以结合于Dok5上游的FHBE;染色质免疫共沉淀(ChIP,ChromatinImmunoprecipitation)进一步证实在未诱导的P19CL6细胞,Foxo3a可以结合到Dok5上游启动子区的FHBE,而DMSO诱导6天和12天的P19CL6细胞中Foxo3a不能结合Dok5的FHBE。
已知用DMSO诱导P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中PI3K/Akt通路是激活的,因此我们推测Foxo3a在该过程中发生磷酸化转位到胞浆,不再结合Dok5上游启动子区的FHBE是Dok5mRNA表达升高的原因之一。为了证实这个设想,我们首先通过免疫荧光实验观察到P19CL6向心肌细胞分化过程中存在Foxo3a从胞核到胞浆的转位,WesternBlot的方法也证实该过程中Foxo3a的磷酸化水平明显升高。
为了进一步确证Foxo3a对Dok5基因表达调控的作用,我们在P19CL6细胞系中使用含有Dok5启动子区的报告基因系统检测了Foxo3a对其转录活性的影响,同时观察了野生型和磷酸化位点突变型Foxo3a(triplemutant,TM即Akt磷酸化位点T32A/S253A/S315A突变的Foxo3a)在P19CL6细胞和293ET细胞中的分布情况。结果发现过表达野生型Foxo3a对报告基因活性没有明显的抑制作用,它在胞浆胞核广泛分布,以胞浆分布为主;突变型的Foxo3a可以明显抑制Dok5报告基因的活性,以胞核分布为主。这些结果表明,Foxo3a对Dok5基因的转录起到抑制作用,这种抑制作用随着Foxo3a发生磷酸化,定位到胞浆而减弱甚至消失。
为了检验上述结论,我们用Foxo3a的siRNA抑制Foxo3a的内源性表达,发现Dok5mRNA的表达水平增高,该结果进一步说明Foxo3a对Dok5基因表达起到负调控作用。
以上研究结果初步证明,Foxo3a对Dok5的转录起重要的抑制作用。当用1%DMSO刺激P19CL6细胞向心肌细胞分化时,PI3K/Akt通路活化,磷酸化Foxo3a使其定位到胞浆中,从而使Foxo3a不能结合Dok5启动子区的FHBE,减弱了Foxo3a对Dok5的转录抑制作用,Dok5的表达水平增高。
在完成上述工作的基础上,我们还用蛋白质组学的方法寻找P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达的蛋白。通过双向电泳发现了17个差异表达的蛋白点,经过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析,最终鉴定出16个差异表达的蛋白点。其中,诱导分化后表达上调的有13个蛋白点,分化后表达下调的有3个蛋白点。对这些差异蛋白的分析结果表明,它们在分化过程中与能量代谢、信号传导、细胞骨架形成等有关。