【摘 要】
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目的探讨环磷酰胺导致小鼠卵巢颗粒细胞损伤后,基因组差异性表达谱的变化,以及补肾还精方以细胞色素P450为靶点,缓解小鼠卵巢颗粒细胞损伤及卵巢早衰的作用机制。方法在体外研究中,使用酶消化法分离并培养原代小鼠卵巢颗粒细胞（m OGCs）,构建环磷酰胺诱导的m OGCs细胞损伤模型,并以等剂量PBS干预m OGCs作为对照组。采用PI染色/流式细胞术,检测各组m OGCs细胞周期变化;Western b
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81973899）； 上海市自然科学基金项目（No 16ZR1434000）； 上海市人才发展资金资助计划（2017054）； 上海中医药大学杏林学者基金项目（201707081）； 上海中医药大学研究生“创新能力培养”专项研究项目（Y2
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目的探讨环磷酰胺导致小鼠卵巢颗粒细胞损伤后,基因组差异性表达谱的变化,以及补肾还精方以细胞色素P450为靶点,缓解小鼠卵巢颗粒细胞损伤及卵巢早衰的作用机制。方法在体外研究中,使用酶消化法分离并培养原代小鼠卵巢颗粒细胞（m OGCs）,构建环磷酰胺诱导的m OGCs细胞损伤模型,并以等剂量PBS干预m OGCs作为对照组。采用PI染色/流式细胞术,检测各组m OGCs细胞周期变化;Western blot法检测各组m OGCs细胞老化和凋亡标志物的表达情况;RNA-seq法分析细胞基因转录组学的差异性表达谱;Co-IP Western blot法检测蛋白质间相互作用情况。在体内研究中,将72只10周龄的C57/BL6雌性小鼠,随机分成6组:空白组、模型组、补肾还精方低剂量组、中剂量组、高剂量组及还精煎组,每组12只。连续7天,对除空白组外的5组小鼠采用腹腔注射70mg/kg剂量的环磷酰胺,以构建POF小鼠模型。随后空白组和模型组小鼠予以生理盐水灌胃,其余各组予以相应组别的药物水剂灌胃,每日1次,共30天;同时除空白组外,其余各组每2天腹腔注射30mg/kg环磷酰胺直至灌胃结束。采用HE染色法检测小鼠卵巢病理形态,并进行各级卵泡计数;HPLC-MS/MS法检测小鼠血清中甾体激素的水平;JC-1探针标记法检测线粒体膜电位完整性;q PCR法和免疫荧光染色法分别检测细胞色素P450家族相关基因和细胞衰老凋亡基因m RNA及蛋白质表达水平。结果1.与PBS对照组相比,环磷酰胺处理m OGCs后,其细胞周期进程受到阻滞（P＜0.05）;AMH和Inhibinα蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;ΔCaspase 3和pho-H2A.X蛋白的表达量显著提高（P＜0.01）;2.RNA-Seq测序结果指出,两组之间存在18765个差异转录基因,其中,192个显著上调表达（log2[POF/PBS]＞2.0）,116个显著下调表达（log2[POF/PBS]＜-4.0）;GO分析和KEGG分析结果显示,环磷酰胺处理m OGCs后,会引起多个基因转录和表达紊乱;其中,属于卵巢类固醇生成（Ovarian steroidogenesis）功能的基因转录活性相较PBS组显著下降（P＜0.01）;在122个差异表达的基因中,以log2[POF/PBS]＜-3.0为标准筛选出20个基因;3.在线预测分析上述20个基因编码的蛋白关联性,结果提示,细胞色素P450家族CYP17A1,CYP11A1,CYP2U1与FDX1蛋白形成相互作用网络;Co-IP Western blot结果显示,上述4个蛋白存在相互作用,且环磷酰胺显著诱导其下调表达（P＜0.05）;4.相较模型组,补肾还精方干预后,小鼠卵巢萎缩情况改善,间质疏松,闭锁卵泡数量减少,正常卵泡数量增加（P＜0.01）;5.补肾还精方干预后,小鼠线粒体膜电位相较模型组显著升高（P＜0.01）;6.HPLC-MS/MS结果提示,补肾还精方干预后血清中雌二醇、黄体酮、皮质醇表达量相较模型组增加（P＜0.05）,而雌三醇、醛固酮、皮质酮的表达量降低（P＜0.05）;7.补肾还精方干预后,卵巢P450蛋白表达水平以及m RNA表达水平高于模型组（P＜0.05）,凋亡相关蛋白表达水平和m RNA表达水平降低（P＜0.05）。结论1.细胞色素P450家族蛋白CYP17A1,CYP11A1,CYP2U1和FDX1可形成蛋白质相互作用网络,其与小鼠卵巢颗粒细胞损伤存在密切关系;2.补肾还精方可以显著改善实验性POF小鼠模型的卵巢病理学特征,缓解环磷酰胺诱发的卵巢颗粒细胞损伤及闭锁卵泡的产生,改善卵巢微环境,纠正雌激素代谢及皮质激素代谢紊乱状况;3.补肾还精方可以显著提高POF组小鼠卵巢颗粒细胞中,P450蛋白家族成员CYP17A1,CYP11A1,CYP2U1和FDX1的表达水平,并抑制衰老凋亡蛋白的表达,从而改善卵巢颗粒细胞损伤情况。
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