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既往有很多的文献研究显示,IKBKE(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon)作为非经典IKK激酶的家族一员,其在炎症性及代谢性疾病中起着重要的作用。近来,IKBKE被认为是一种致瘤性的蛋白,其在许多肿瘤中出现高表达现象,沉默IKBKE表达后,肿瘤进展会受到抑制,因此IKBKE在肿瘤靶向治疗中成为一个非常具有潜力的新靶点。作为IKBKE的小分子抑制剂,amlexanox被报道具有抗炎、抗过敏、调节免疫功能等作用,已经在临床上应用其治疗口腔溃疡、过敏性哮喘和肥胖等疾病。在本论文中,我们展示了amlexanox具有抑制胶质母细胞瘤细胞生长、迁移和侵袭的作用,同时还可以诱导肿瘤细胞周期阻滞在G0/G1期以及诱导其发生细胞凋亡等作用。Amlexanox可以与IKBKE相结合,调节其激酶的活性,降低其蛋白表达水平。进一步的机制研究则表明,IKBKE与LATS1/2直接结合,沉默IKBKE可以改变Hippo通路核心蛋白LATS1/2蛋白表达量,从而激活Hippo通路,抑制胶质母细胞瘤发展。裸鼠体内实验结果进一步显示amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下肿瘤和颅内肿瘤的生长,延长裸鼠的生存时间。这些研究表明amlexanox在治疗胶质母细胞瘤中具有重要的应用价值。方法1.首先确定胶质瘤母细胞瘤细胞(U87和U251)在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间下的存活率(CCK-8实验),计算其半数抑制浓度IC50,从而确定实验所需的浓度梯度;2.利用流式细胞仪技术检测amlexanox对肿瘤细胞周期及凋亡的影响;3.利用细胞克隆形成实验检测amlexanox对肿瘤细胞增殖的影响,利用Transwell实验检测amlexanox对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响;4.利用蛋白免疫印迹的方法(western blot,WB)检测amlexanox对U87和U251细胞IKBKE和Hippo通路核心蛋白表达量的影响;5.利用WB检测沉默(shRNA)和过表达(重组质粒)IKBKE后,U87和U251细胞Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白表达量的变化;6.利用WB及免疫荧光技术(IF)检测沉默IKBKE后,U87和U251细胞Hippo通路核心蛋白胞浆和胞核内的变化;7.利用qRT-PCR检测沉默IKBKE后,LATS1/2在转录水平的变化;利用免疫共沉淀(Co-IP)和WB检测IKBKE与LATS1,IKBKE与LATS2是否存在内源性结合,沉默IKBKE后LATS2泛素化水平变化;8.建立裸鼠皮下肿瘤模型(U87细胞),腹腔内注射amlexanox(100mg/kg/day),监测肿瘤体积和裸鼠体重变化,处死裸鼠后,比较对照组和实验组肿瘤重量,免疫组化(IHC)检测IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的变化;9.利用立体定向技术将转染了luciferase病毒的U87细胞注入裸鼠颅内,建立裸鼠颅内肿瘤模型,腹腔内注射amlexanox(100mg/kg/day),活体成像技术监测颅内肿瘤体积变化,记录裸鼠生存时间,IHC检测IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的变化。结果1.Amlexanox可以抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖及集落形成;2.Amlexanox可以抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力;3.Amlexanox可以使胶质母细胞瘤细胞阻滞在G0/G1期,并且可以诱导其发生细胞凋亡;4.Amlexanox可以在转录后水平影响IKBKE蛋白表达,进而改变Hippo通路核心蛋白表达量及磷酸化状态;5.IKBKE可以直接与LATS1/2相结合,沉默IKBKE可以通过抑制LATS1/2泛素化和降解,从而激活了Hippo通路;6.经蛋白酶体抑制剂MG132处理后,IKBKE促进LATS1/2降解的过程受到抑制;7.Amlexanox可以有效抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,且短期内对裸鼠的体重不会产生明显的影响,IHC检测发现Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表达量减少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表达量则升高;8.Amlexanox可以有效抑制裸鼠颅内肿瘤的生长,延长其生存时间,IHC检测发现Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表达量减少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表达量则升高;结论1.Amlexanox可以有效的抑制胶质母细胞瘤细胞的生长,降低了IKBKE蛋白表达,改变了Hippo通路核心蛋白表达量及磷酸化状态;2.IKBKE可以直接与LATS1/2相结合,沉默IKBKE抑制了LATS1/2泛素化及降解水平,从而激活了Hippo通路,抑制了胶质母细胞瘤的发展;3.Amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下肿瘤和颅内肿瘤的进展,而这主要是通过抑制IKBKE活性及表达量,激活Hippo通路实现的。