基因芯片靶向预测骨髓间充质干细胞骨向分化中miR-10b-3p与circRNA联接位点的研究

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背景:  人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)是具有多向分化潜能的非造血来源多能干细胞。它在特定条件下,可向骨细胞、脂肪细胞及神经元细胞等方向分化。此类细胞易于分离、培养以及扩增。扩增后仍保留分化潜能,并且具有低免疫原性、免疫调节功能、易于转染和稳定表达外源基因等特征。因此,它有望被应用于牙根吸收、牙槽骨丧失等组织修复的治疗中。  MicroRNAs(miRNAs)是一类长约16~25个核苷酸的小分子非编码RNA,它们能够调控特定的靶基因表达。大量研究表明,干细胞的增殖、分化处于miRNAs的调控之中。本课题组前期运用基因芯片及实时荧光定量PCR(quantitative RT-PCR,q-PCR)的实验结果显示miR-10b-3p在骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基诱导人骨髓间充质干细胞(humanbone mesenchymal stem cells,hBMSCs)分化过程中表达明显降低,且通过体外及体内实验对miR-10b-3p进行了功能验证,明确了其在hBMSCs向成骨/成牙骨质方向分化过程中的生物学作用。  环形RNA(Circular RNA,circRNA)是一种特殊的非编码RNA分子,与线型RNA不同,它呈封闭环状结构,比线性RNA稳定,不易被核酸外切酶降解。尤其是近年来发现它具有miRNA海绵和调控转录的功能,是分子生物学领域的研究热点。由于circRNA具有重要的生物学功能,猜想它也可能通过与miRNA相互作用,在hBMSCs的骨向分化过程中发挥着调控功能。因而我们认为miR-10b-3p在骨髓间充质干细胞向成骨/成牙骨质方向分化过程中的生物学作用受到特定的circRNA调控,并且希望通过对相关circRNA与miR-10b-3p结合位点的研究,进一步探索hBMSCs的骨向分化过程。  目的:  1.检测hBMSCs成骨前后整体circRNAs的差异性表达情况,并预测差异性表达circRNAs的miRNAs结合位点,为以后研究circRNAs在hBMSCs骨向分化中所起的作用提供了一个有用的数据库。  2.探讨hBMSCs骨向分化过程中特异性circRNA与miR-10b-3p的联接,为进一步研究circRNA在其中的机制提供线索。  方法:  1.利用免疫细胞化学、成骨/成脂诱导染色鉴定复苏传代后的hBMSCs的来源及分化能力。  2.对hBMSCs进行骨向诱导,circRNA芯片检测hBMSCs成骨前后circRNAs的差异表达。  3.预测hBMSCs骨向分化过程中特异的circRNA与miR-10b-3p联接位点。  结果:  1.hBMSCs阳性表达间充质干细胞表面标志物CD44,而阴性表达造血干细胞标志物CD34;同时经成骨诱导21d茜素红矿化染色显示,诱导组红染的矿化结节明显多于对照组;成脂诱导21d后油红O染色显示,诱导组的橘红色脂滴较对照组多。  2.hBMSCs骨向诱导21d后,circRNA芯片检测到差异性表达的circRNAs有88个,其中26个表达上调,62个表达下调。其中与miR-10b-3p有结合位点的circRNA包括hsa-circRNA-101846、hsa-circRNA-101889。  3.Hsa-circRNA-101846在hBMSCs骨向诱导21d后高表达,倍数为4.01±1.07。  结论:  用基因芯片获得了hBMSCs骨向分化前后88个差异表达的circRNAs,为以后研究circRNA在hBMSCs骨向分化中的作用提供了一个有用的数据库。靶向预测到hsa-circRNA-101846可能通过与miRNA-10b-3p相互作用在hBMSCs骨向分化中发挥调控功能,为进一步研究circRNA在其中的作用机制提供了线索。
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