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目的：
1.通过构建脓毒症小鼠模型，探究pY-STAT3抑制剂和总STAT3抑制剂能否通过改善炎症反应和凝血失衡降低脓毒症小鼠死亡率，揭示pY-STAT3抑制剂对脓毒症小鼠肺损伤的作用及机制。
2.通过构建LPS诱导的脓毒症细胞模型，探究pY-STAT3抑制剂对LPS引起的内皮细胞损伤的作用；阐明pY-STAT3抑制剂对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应和组织因子（TF）等促凝指标表达的影响和机制，通过点突变抑制巨噬细胞pY-STAT3的表达，从基因层面验证pY-STAT3在巨噬细胞调控炎症反应和TF表达中的作用。
方法：
一、动物实验:
1.将雄性8-10周C57BL/6小鼠随机分成四组：Sham组（假手术组）、CLP组（脓毒症模型组）、CLP+BP组（BP-1-102治疗组）和CLP+Na组（Napabucasin治疗组）。
2.对于后续样品检测，各组小鼠于CLP造模后24小时收集血浆及肺组织。
二、细胞实验：
1.人肺微血管内皮细胞（HPMEC）可分为四组：DMSO组（空白对照组）、BP组（BP对照组）、LPS组（LPS刺激组）和LPS+BP组（BP预处理组）。
2.将Raw264.7巨噬细胞分为四组：DMSO组（空白对照组）、BP组（BP对照组）、LPS组（LPS刺激组）和LPS+BP组（BP预处理组）。
3.将慢病毒感染的Raw264.7巨噬细胞分为四组：Ctrl组（对照病毒组）、pY-STAT3mut组（pY-STAT3mut对照组）、Ctrl+LPS组（对照病毒细胞LPS刺激组）和pY-STAT3mut+LPS组（pY-STAT3mut细胞LPS刺激组）。
4.将小鼠腹腔巨噬细胞（PM）分为四组：WT+PBS组（野生型小鼠PM+PBS空白对照组）、WT+LPS组（野生型小鼠PM+LPS刺激组）、TLR4mut+PBS组（TLR4突变小鼠PM+PBS空白对照组）和TLRmut+LPS组（TLR4突变小鼠PM+LPS刺激组）。
结果：
一、动物实验：
1.Sham组小鼠96小时生存率为100%，而CLP组小鼠在54小时全部死亡（P＜0.01）。CLP+BP组小鼠生存率为50%，生存率较CLP组小鼠明显得到改善（P＜0.01）。但是CLP+Na组小鼠的生存率仅为8.3%，与CLP组小鼠无显著性差异。
2.CLP模型24小时后，CLP组小鼠血浆中炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α和CXCL10，凝血指标TF、PAI1、TAT和D-Dimer较Sham组小鼠均明显升高（P＜0.05），而CLP+BP组小鼠血浆中除PAI1以外上述指标均较CLP组小鼠明显下降（P＜0.05）。但是CLP+Na组小鼠血浆中上述指标与CLP组相比并无明显差异。
3.CLP模型24小时后，与Sham组肺组织相比，CLP组小鼠肺组织损伤严重，可见大量炎性细胞浸润，正常肺泡结构破坏并水肿，肺泡壁增厚；而给予BP预处理后，可发现CLP小鼠肺组织损伤情况明显得到改善。
二、细胞实验
1.应用CCK-8筛选最佳的BP药物浓度，我们发现当BP浓度为7,10,15μM时，HPMEC细胞活力显著下降（P＜0.01），浓度为5μM时，细胞活力未受到影响。因此我们挑选5μM作为细胞最适浓度用于后续HPMEC相关细胞实验。在LPS刺激下，24小时后HPMEC细胞增殖水平显著升高（P＜0.01），然而BP干预并未影响LPS刺激下的细胞增殖。与DMSO对照组相比，BP对照组内皮细胞成环情况受到抑制，LPS促进了HPMEC成环现象的发生，而在LPS+BP组，HPMEC成环现象受到抑制。在LPS刺激下，通过HPMEC细胞层渗漏出的HRP量明显增多（P＜0.01），而LPS+BP组中渗漏的HRP量与LPS组相比有所减少（P＜0.05）。我们发现各组细胞培养上清液中VE-Cadherin水平均未发生变化，各组细胞裂解液中VE-Cadherin和α-E-catenin蛋白水平也均未发生变化。进一步研究发现，LPS刺激组中，VE-Cadherin和α-E-catenin组成的细胞连接发生破坏断裂和结构紊乱，而在LPS+BP组中，这种细胞连接的破坏得到一定程度的修复。由此可见，BP通过保护VE-Cadherin和α-E-catenin组成的细胞连接结构的完整性改善LPS刺激下的HPMEC的渗漏。与DMSO组相比，LPS刺激6小时后，TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP1，CXCL1，CXCL10和COX2这些炎症指标mRNA水平显著升高（P＜0.05），而给予BP干预后，除了CXCL1和COX2外上述其他指标mRNA表达量均明显下调（P＜0.05）；LPS刺激下，凝血指标也受到影响，促凝指标TF和PAI1表达升高（P＜0.01），抗凝指标TM和EPCR水平下降（P＜0.05）。然而，抑制剂BP并不能改善这些紊乱的凝血指标。与DMSO组相比，LPS刺激6小时后，HPMEC中pY-STAT3、p-JAK2、p-IκBα、p-JNK、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平显著升高；BP能够明显抑制LPS诱导的STAT3/NFκB/MAPK信号通路的活化。
2.CCK-8筛选最佳的BP药物浓度，我们发现当BP浓度为7，10，15μM时，Raw264.7细胞活力显著下降（P＜0.01），浓度为5μM时，细胞活力未受到影响。因此我们挑选5μM作为细胞最适浓度用于后续Raw264.7相关细胞实验。在LPS刺激下，24小时后Raw264.7细胞增殖水平显著升高（P＜0.01）；给予BP干预后，LPS刺激下升高的Raw264.7细胞增殖水平明显受到抑制（P＜0.01）。LPS刺激6小时后，Raw264.7细胞培养上清液中IL-6，TNF-α和TF表达量大量升高（P＜0.01）；而在LPS+BP组细胞培养上清液中，IL-6，TNF-α和TF表达量较LPS组明显下降（P＜0.01）。LPS刺激下Raw264.7细胞TF荧光亮度明显增强，而给予BP处理后，TF的荧光强度减弱。与DMSO组相比，LPS刺激6小时后，Raw264.7细胞中TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，MCP1，CXCL1，CXCL10，CXCL16，ICAM1，COX2，MMP1和MMP9这些炎症指标mRNA水平显著升高（P＜0.05），而给予BP干预后，除了CXCL16，ICAM1和COX2外上述其他指标mRNA表达量均明显下调（P＜0.05）；LPS刺激下，促凝指标TF和PAI1表达明显升高，BP能够下调TF的表达，但并不能下调升高的PAI1水平。在LPS刺激下，Raw264.7细胞中pY-STAT3，p-JAK2，p-IκBα，p-IKKα/β，p-P65，p-JNK，p-P38，p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平显著升高；BP能够明显抑制LPS诱导的STAT3/NFκB/MAPK信号通路的活化。此外，BP还能够明显下调LPS刺激引起的升高的TNF-α蛋白水平。
3.在LPS刺激下，24小时后对照病毒组Raw264.7细胞增殖水平显著升高（P＜0.01）；而pY-STAT3mut+LPS组细胞增殖水平明显受到抑制（P＜0.05）。LPS刺激6小时后，对照病毒组Raw264.7细胞培养上清液中IL-6，TNF-α和TF表达量大量升高（P＜0.01）；而在pY-STAT3mut+LPS组细胞培养上清液中，IL-6，TNF-α和TF表达量较Ctrl+LPS组明显下降（P＜0.05）。LPS刺激下对照病毒转染的Raw264.7细胞TF荧光亮度明显增强，而在pY-STAT3mut+LPS组中，TF的荧光强度减弱。与Ctrl组相比，LPS刺激6小时后，Ctrl+LPS组Raw264.7细胞中TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，MCP1，CXCL1，CXCL10，MMP1，MMP9和TF这些炎症和凝血相关指标mRNA水平显著升高（P＜0.01），而在pY-STAT3mut+LPS组，除了MMP9外上述其他指标mRNA表达量均明显下调（P＜0.05）。
4.在WT+LPS组中，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，CXCL1，PAR1和TF这些炎症或凝血相关指标mRNA水平均显著升高（P＜0.05），而在TLRmut+LPS组，这些升高的指标mRNA表达量均明显下降（P＜0.05）。WT+LPS组中，pY-STAT3蛋白表达量明显升高，而在TLRmut+LPS组中，细胞pY-STAT3蛋白表达并未明显升高。
结论：
1.pY-STAT3抑制剂BP，而非总STAT3抑制剂Na，能够通过改善炎症反应和凝血失衡保护脓毒症小鼠肺功能并降低死亡率。
2.BP能够通过调控STAT3/NFκB/MAPK信号通路和VE-Cadherin/α-E-catenin的定位降低LPS刺激下HPMEC的炎症反应和内皮渗漏。
3.应用pY-STAT3抑制剂BP或基因突变pY-STAT3位点均能够通过调控STAT3/NFκB/MAPK信号通路降低LPS诱导的巨噬细胞炎症因子和TF的表达。
4.巨噬细胞中TLR4参与调控pY-STAT3相关的炎症反应和TF的表达。
1.通过构建脓毒症小鼠模型，探究pY-STAT3抑制剂和总STAT3抑制剂能否通过改善炎症反应和凝血失衡降低脓毒症小鼠死亡率，揭示pY-STAT3抑制剂对脓毒症小鼠肺损伤的作用及机制。
2.通过构建LPS诱导的脓毒症细胞模型，探究pY-STAT3抑制剂对LPS引起的内皮细胞损伤的作用；阐明pY-STAT3抑制剂对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应和组织因子（TF）等促凝指标表达的影响和机制，通过点突变抑制巨噬细胞pY-STAT3的表达，从基因层面验证pY-STAT3在巨噬细胞调控炎症反应和TF表达中的作用。
方法：
一、动物实验:
1.将雄性8-10周C57BL/6小鼠随机分成四组：Sham组（假手术组）、CLP组（脓毒症模型组）、CLP+BP组（BP-1-102治疗组）和CLP+Na组（Napabucasin治疗组）。
2.对于后续样品检测，各组小鼠于CLP造模后24小时收集血浆及肺组织。
二、细胞实验：
1.人肺微血管内皮细胞（HPMEC）可分为四组：DMSO组（空白对照组）、BP组（BP对照组）、LPS组（LPS刺激组）和LPS+BP组（BP预处理组）。
2.将Raw264.7巨噬细胞分为四组：DMSO组（空白对照组）、BP组（BP对照组）、LPS组（LPS刺激组）和LPS+BP组（BP预处理组）。
3.将慢病毒感染的Raw264.7巨噬细胞分为四组：Ctrl组（对照病毒组）、pY-STAT3mut组（pY-STAT3mut对照组）、Ctrl+LPS组（对照病毒细胞LPS刺激组）和pY-STAT3mut+LPS组（pY-STAT3mut细胞LPS刺激组）。
4.将小鼠腹腔巨噬细胞（PM）分为四组：WT+PBS组（野生型小鼠PM+PBS空白对照组）、WT+LPS组（野生型小鼠PM+LPS刺激组）、TLR4mut+PBS组（TLR4突变小鼠PM+PBS空白对照组）和TLRmut+LPS组（TLR4突变小鼠PM+LPS刺激组）。
结果：
一、动物实验：
1.Sham组小鼠96小时生存率为100%，而CLP组小鼠在54小时全部死亡（P＜0.01）。CLP+BP组小鼠生存率为50%，生存率较CLP组小鼠明显得到改善（P＜0.01）。但是CLP+Na组小鼠的生存率仅为8.3%，与CLP组小鼠无显著性差异。
2.CLP模型24小时后，CLP组小鼠血浆中炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α和CXCL10，凝血指标TF、PAI1、TAT和D-Dimer较Sham组小鼠均明显升高（P＜0.05），而CLP+BP组小鼠血浆中除PAI1以外上述指标均较CLP组小鼠明显下降（P＜0.05）。但是CLP+Na组小鼠血浆中上述指标与CLP组相比并无明显差异。
3.CLP模型24小时后，与Sham组肺组织相比，CLP组小鼠肺组织损伤严重，可见大量炎性细胞浸润，正常肺泡结构破坏并水肿，肺泡壁增厚；而给予BP预处理后，可发现CLP小鼠肺组织损伤情况明显得到改善。
二、细胞实验
1.应用CCK-8筛选最佳的BP药物浓度，我们发现当BP浓度为7,10,15μM时，HPMEC细胞活力显著下降（P＜0.01），浓度为5μM时，细胞活力未受到影响。因此我们挑选5μM作为细胞最适浓度用于后续HPMEC相关细胞实验。在LPS刺激下，24小时后HPMEC细胞增殖水平显著升高（P＜0.01），然而BP干预并未影响LPS刺激下的细胞增殖。与DMSO对照组相比，BP对照组内皮细胞成环情况受到抑制，LPS促进了HPMEC成环现象的发生，而在LPS+BP组，HPMEC成环现象受到抑制。在LPS刺激下，通过HPMEC细胞层渗漏出的HRP量明显增多（P＜0.01），而LPS+BP组中渗漏的HRP量与LPS组相比有所减少（P＜0.05）。我们发现各组细胞培养上清液中VE-Cadherin水平均未发生变化，各组细胞裂解液中VE-Cadherin和α-E-catenin蛋白水平也均未发生变化。进一步研究发现，LPS刺激组中，VE-Cadherin和α-E-catenin组成的细胞连接发生破坏断裂和结构紊乱，而在LPS+BP组中，这种细胞连接的破坏得到一定程度的修复。由此可见，BP通过保护VE-Cadherin和α-E-catenin组成的细胞连接结构的完整性改善LPS刺激下的HPMEC的渗漏。与DMSO组相比，LPS刺激6小时后，TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP1，CXCL1，CXCL10和COX2这些炎症指标mRNA水平显著升高（P＜0.05），而给予BP干预后，除了CXCL1和COX2外上述其他指标mRNA表达量均明显下调（P＜0.05）；LPS刺激下，凝血指标也受到影响，促凝指标TF和PAI1表达升高（P＜0.01），抗凝指标TM和EPCR水平下降（P＜0.05）。然而，抑制剂BP并不能改善这些紊乱的凝血指标。与DMSO组相比，LPS刺激6小时后，HPMEC中pY-STAT3、p-JAK2、p-IκBα、p-JNK、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平显著升高；BP能够明显抑制LPS诱导的STAT3/NFκB/MAPK信号通路的活化。
2.CCK-8筛选最佳的BP药物浓度，我们发现当BP浓度为7，10，15μM时，Raw264.7细胞活力显著下降（P＜0.01），浓度为5μM时，细胞活力未受到影响。因此我们挑选5μM作为细胞最适浓度用于后续Raw264.7相关细胞实验。在LPS刺激下，24小时后Raw264.7细胞增殖水平显著升高（P＜0.01）；给予BP干预后，LPS刺激下升高的Raw264.7细胞增殖水平明显受到抑制（P＜0.01）。LPS刺激6小时后，Raw264.7细胞培养上清液中IL-6，TNF-α和TF表达量大量升高（P＜0.01）；而在LPS+BP组细胞培养上清液中，IL-6，TNF-α和TF表达量较LPS组明显下降（P＜0.01）。LPS刺激下Raw264.7细胞TF荧光亮度明显增强，而给予BP处理后，TF的荧光强度减弱。与DMSO组相比，LPS刺激6小时后，Raw264.7细胞中TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，MCP1，CXCL1，CXCL10，CXCL16，ICAM1，COX2，MMP1和MMP9这些炎症指标mRNA水平显著升高（P＜0.05），而给予BP干预后，除了CXCL16，ICAM1和COX2外上述其他指标mRNA表达量均明显下调（P＜0.05）；LPS刺激下，促凝指标TF和PAI1表达明显升高，BP能够下调TF的表达，但并不能下调升高的PAI1水平。在LPS刺激下，Raw264.7细胞中pY-STAT3，p-JAK2，p-IκBα，p-IKKα/β，p-P65，p-JNK，p-P38，p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平显著升高；BP能够明显抑制LPS诱导的STAT3/NFκB/MAPK信号通路的活化。此外，BP还能够明显下调LPS刺激引起的升高的TNF-α蛋白水平。
3.在LPS刺激下，24小时后对照病毒组Raw264.7细胞增殖水平显著升高（P＜0.01）；而pY-STAT3mut+LPS组细胞增殖水平明显受到抑制（P＜0.05）。LPS刺激6小时后，对照病毒组Raw264.7细胞培养上清液中IL-6，TNF-α和TF表达量大量升高（P＜0.01）；而在pY-STAT3mut+LPS组细胞培养上清液中，IL-6，TNF-α和TF表达量较Ctrl+LPS组明显下降（P＜0.05）。LPS刺激下对照病毒转染的Raw264.7细胞TF荧光亮度明显增强，而在pY-STAT3mut+LPS组中，TF的荧光强度减弱。与Ctrl组相比，LPS刺激6小时后，Ctrl+LPS组Raw264.7细胞中TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，MCP1，CXCL1，CXCL10，MMP1，MMP9和TF这些炎症和凝血相关指标mRNA水平显著升高（P＜0.01），而在pY-STAT3mut+LPS组，除了MMP9外上述其他指标mRNA表达量均明显下调（P＜0.05）。
4.在WT+LPS组中，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，CXCL1，PAR1和TF这些炎症或凝血相关指标mRNA水平均显著升高（P＜0.05），而在TLRmut+LPS组，这些升高的指标mRNA表达量均明显下降（P＜0.05）。WT+LPS组中，pY-STAT3蛋白表达量明显升高，而在TLRmut+LPS组中，细胞pY-STAT3蛋白表达并未明显升高。
结论：
1.pY-STAT3抑制剂BP，而非总STAT3抑制剂Na，能够通过改善炎症反应和凝血失衡保护脓毒症小鼠肺功能并降低死亡率。
2.BP能够通过调控STAT3/NFκB/MAPK信号通路和VE-Cadherin/α-E-catenin的定位降低LPS刺激下HPMEC的炎症反应和内皮渗漏。
3.应用pY-STAT3抑制剂BP或基因突变pY-STAT3位点均能够通过调控STAT3/NFκB/MAPK信号通路降低LPS诱导的巨噬细胞炎症因子和TF的表达。
4.巨噬细胞中TLR4参与调控pY-STAT3相关的炎症反应和TF的表达。