近年来,禽流感特别是高致病性禽流感给养禽业带来毁灭性的打击,并引发一系列的公共卫生安全问题。鸡、鸭同为家禽,对流感病毒有着不同的敏感性,这与宿主本身抗性基因和免疫相关基因的表达调控存在着密切的关系。维甲酸诱导基因I (Retinoic acid inducible gene Ⅰ, RIG-I)能识别流感病毒并触发先天性免疫,该基因在鸡基因组上缺失,鸭基因组中保留,这种缺失使得鸡与其他禽类相比对禽流感病毒更易感、临床症状更明显。但到目前为止,鸭RIG-I是如何发挥抗病毒作用尚不清楚。本实验尝试从不同角度阐释鸭RIG-I在免疫调节中的作用及分子调控机制,旨在揭示duRIG-I在抗病毒先天性免疫信号传递途径及其代偿机制,并以期进一步完善鸡体内抗病毒先天性免疫途径及禽类免疫系统相关的基础研究。主要研究内容如下：1.为探讨duRIG-I基因的功能,首先克隆获得了duRIG-I cDNA序列,提交GenBank(登录号为JQ946323.2和KC869660.1),发现了3’UTR存在可变剪接体；间接免疫荧光方法检测结果显示duRIG-I蛋白主要位于细胞质,其次位于细胞核,进一步证实了该蛋白为胞质受体；半定量RT-PCR检测结果显示duRIG-I在心、肝、肾、腺胃、大肠、小肠、肌肉、胸腺和下丘脑等组织的本底表达均处于较低水平,仅在脾脏和肺脏组织中有少量表达；进一步采用poly[I:C]模拟病毒感染,实时定量PCR检测感染96h内的脾脏和肝脏中的duRIG-I基因的mRNA动态表达变化,发现感染8h后脾脏和肝脏中duRIG-I基因表达量均显著上升(P<0.05)。2.基于上述duRIG-I基因呈诱导性表达的特点,我们开展了duRIG-I表达调控研究。首先克隆了duRIG-I启动子区,在线预测发现该基因启动子区存在一个明显的CpG岛,但BSP进一步检测结果显示,脾脏等中RIG-I启动子区的CpG岛处于非甲基化状态。双荧光素酶报告基因系统检测duRIG-I基因启动子转录活性结果显示,在+14～-301 bp存在正调控,该区的转录因子结合位点预测结果表明,IRF1等反式作用因子可能起着重要作用。3.为了证实duRIG-I的激活机制,对duRIG-I进行保守结构域预测,发现duRIG-I基因具有RLRs家族的典型特征(包括CARD结构域、RNA解旋酶等功能结构域),据此构建了不同结构域缺失突变体的表达载体,经RT-PCR,间接免疫荧光和Western blot方法鉴定重组质粒的表达,利用RT-qPCR检测结果发现CARD结构域能介导RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达显著上调；进一步采用NF-κB荧光素酶报告系统和ELISA检测poly[I:C]介导的IFN-β的表达量,结果发现经poly[I:C]诱导,duRIG-Ⅰ被显著激活,同时CARDs结构域能够通过激活NF-κB促使IFN-β的产生。4.为进一步探索duRIG-I基因在抗病毒先天性免疫中的作用,慢病毒介导的duRIG-I基因在DF-1细胞中持续稳定高表达,获得了稳转细胞株DF-1/LV5-RIG-I和DF-1/LV5,并用RT-PCR及Western Blot验证duRIG-I基因mRNA水平和蛋白水平的表达情况,为下一步研究提供了细胞模型。5.为探索duRIG-I在抗病毒先天性免疫信号传递途径及其代偿机制,我们利用5’ppp-dsRNA模拟病毒感染,进行RNA-seq,共筛选出278个差异基因(duRIG-I基因介导的应答基因),其中120个差异基因被注释到KEGG数据库中,富集分析最可靠的通路为RIG-I样受体信号通路；GO二级功能的富集分析主要富集在Ⅰ型干扰素信号通路、T细胞介导的细胞毒性正向调控、β干扰素的细胞应答、RIG-I信号通路的正向调控等条目；通过Cytoscape软件,基于通路上共有的差异基因,构建了RIG-I信号通路与其他信号通路交联的关系网路图,推测Jak-STAT信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体关联、Wnt信号通路、泛素介导的蛋白水解作用、MAPK信号通路等在抗病毒信号转导过程中可能与RIG-I介导的通路存在分子交联；经进一步筛选得到RIG-I介导信号通路关键应答基因,如ISG12-2、OSA*A、Mx1、IFIT5、TRIM25、USP18、STAT1、STAT2、IRF1、 IRF3、IRF8等,Real-time PCR验证差异基因表达趋势与测序结果相一致,并结合已有文献报道,提出了鸡中的RIG-I基因介导的信号转导的假设图。