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目的: 制备不同比例的Ⅱ型胶原/壳聚糖/甘油磷酸钠/透明质酸钠温敏水凝胶,探寻最佳浓度比例,评价其生物相容性及生物活性;观察脐带间充质干细胞(hUMSCs)/凝胶复合体对兔退变髓核的修复作用。 方法: 1.温敏型Ⅱ型胶原/壳聚糖/甘油磷酸钠/透明质酸钠水凝胶的制备与生物学评价 以Ⅱ型胶原、壳聚糖、β甘油磷酸钠及透明质酸钠为原料制备Ⅱ型胶原/壳聚糖/甘油磷酸钠/透明质酸钠水凝胶,观察其物理学性状及生物相容性。将上述选出的最优组合凝胶进行HE染色及扫描电镜观察凝胶微观形态。将人脐带间充质干细胞(hUMSCs)与上述选择出的凝胶混合进行共培养,CCK8法检测其生物相容性及细胞增殖情况。向共培养的复合体中加入无诱导、KGN诱导与TGF-β1诱导的DMEM/DF-12培养液共培养,21天后取出进行免疫组化及QPCR检测,观察脐带间充质干细胞(hUMSCs)在凝胶中的向类髓核细胞的生长分化情况。 2.脐带间充质干细胞(hUMSCs)复合Ⅱ型胶原/壳聚糖凝胶对新西兰大白兔退变髓核的修复研究 12只新西兰大白兔随机分为三组:假手术组、抽吸造模组及复合体干预组。假手术组只暴露椎间盘;抽吸造模组暴露椎间盘抽吸造模;复合体干预组抽吸造模并注射入脐带间充质干细胞(hUMSCs)复合Ⅱ型胶原/壳聚糖凝胶复合体。分别在术后4周、8周、12周对三组进行DR及MRI检测,分别对三组进行椎间隙高度测量及核磁共振T2像进行Pfirrmannn分级评分。术后12周,分别取出三组大白兔椎间盘进行HE染色及免疫组化染色,观察复合体干预对兔退变髓核的干预效果。 结果: 1.壳聚糖:β甘油磷酸钠比例为5:3、5:5在37℃水浴锅中均能形成PH近中性的水凝胶,且成胶时间以5:5最短;加入透明质酸钠后,以壳聚糖:β甘油磷酸钠:透明质酸钠比例为5:3:1、5:3:3能够形成温敏凝胶,同时研究还发现透明质酸钠加入缩短了成胶时间,且随着透明质酸钠比例的增加,PH值也有轻度上升;将2%壳聚糖盐酸盐溶液替换为含有5mg/ml的2%壳聚糖盐酸盐溶液,再次进行上述比例的凝胶实验,发现比例为5:3:3的凝胶具有最佳的凝胶形态。将脐带间充质干细胞(hUMSCs)接种入凝胶中,CCK8法检测其生物活性与增殖实验,发现细胞在含有Ⅱ型胶原的凝胶中,具有更好的生物相容性及增值活性。加入无诱导、KGN诱导与TGF-β1诱导的DMEM/DF-12培养液共培养21天后进行免疫组化及QPCR检测,发现hUMSCs均能够在凝胶支架上生长分化为类髓核细胞并表达细胞外基质,且以TGF-β1诱导组最强,差异有统计学意义(P<0.05)。 2.术后4周、8周、12周,假手术组椎间隙高度(DHI)均与抽吸造模组及复合体干预组有统计学差异(P<0.05),而抽吸造模组与复合体干预组则无明显统计学差异(P>0.05);核磁共振评分三组在术后4周、8周、12周均有明显差异,且以假手术组最好,造模组最差(P<0.05)。术后12周,三组大白兔椎间盘HE染色及病理学评分以假手术组最好,复合体干预组其次,抽吸造模组最差,差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅱ型胶原免疫组化结果也显示复合体干预组较抽吸造模组有更多的髓核二型胶原成分。 结论: Ⅱ型胶原/壳聚糖/甘油磷酸钠/透明质酸钠温敏水凝胶具有良好的相容性与生物活性,脐带间充质干细胞(hUMSCs)能够在其中生长分化为类髓核细胞,该细胞凝胶复合体对退变兔髓核有一定修复作用,是一种较好的髓核组织工程材料。