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帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是一种中枢神经系统退行性疾病,其主要病理特征是黑质多巴胺神经元进行性丢失,进一步导致纹状体内多巴胺含量减少,标志物是路易氏小体(lewy body)的形成。PD的主要临床表现是肌强直,进行性运动迟缓,静止性震颤以及姿势步态障碍等。目前,导致这一疾病的确切病因尚未明确,现有研究普遍认为与环境因素、线粒体功能障碍、遗传因素、氧化应激、基因突变、神经毒性、炎症以及自嗜等有关,也可能是由多种因素共同作用的结果。PD多发生在中、老年人群中,而且随着当今社会人口老龄化现象加剧,PD给患者自身以及家庭的生活质量已经带来严重的影响。目前常用的治疗手段有药物治疗、脑深部电刺激、细胞移植以及基因治疗等。PD的症状和体征能够被提高多巴胺神经功能的药物所缓解,其中最有效的是左旋多巴,但是左旋多巴出现的一系列副作用限制了它的广泛应用。更令人失望的是,如果长期使用,左旋多巴可能损害神经元,加速神经元的凋亡。目前为止,尚未找到能够有效治疗PD的药物以及方法,所以探索PD发生发展的机制以及寻找最佳的PD治疗策略具有非常重大的意义。越来越多的研究表明,PD黑质神经元凋亡是由多种神经信号传导通路介导的,如c-jun氨基末端激酶(C-Jun NH2-terminal protein kinase,JNK),P53的激活,细胞周期再激活等。而以往研究表明,tau蛋白是大部分已知通路的共同作用底物。自从发现tau蛋白是阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)中双螺旋丝(paired helical filaments,PHFs)的重要组成成分后,tau蛋白便备受关注。Tau蛋白是一种具有促进微管装备和稳定功能的微管相关蛋白,分布在神经元轴突中。然而,在人脑特异性表位发生过磷酸化时呈现一种病理性变化,并且与退行性疾病以及痴呆等有关。Tau蛋白的功能主要受其磷酸化的调节,在正常的生理条件下,其磷酸化与脱磷酸化处于动态平衡状态。目前,已经发现有超过20种激酶可以磷酸化tau蛋白,其中最重要的则是由脯氨酸指导的糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase,GSK-3)以及细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase,CDK5)。异常过磷酸化的tau蛋白会导致神经元突触丢失,轴突运输缺陷,神经炎症等神经退行性疾病的早期症状,而且过磷酸化的tau蛋白进一步导致双螺旋丝(PHFs),这也是AD和其他tau蛋白病的主要病理特征。所以以tau蛋白为靶点,探索包括PD在内的神经退行性疾病的针对性治疗具有重要的现实意义。1- 甲 基 -4- 苯 基 -1,2,3,6- 四 氢 吡 啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)为一种白色粉末状神经毒剂,具有特异性黑质多巴胺神经元的损害作用,由于其能够复制PD患者的临床表现和病理学特征,如PD患者的震颤麻痹症状、中脑黑质多巴胺能神经元凋亡、纹状体内多巴胺耗竭、行为学损伤并且可引起tau蛋白过度磷酸化,所以作为理想的建模药物广泛应用于PD的研究中。MPTP发生神经损害的作用机制为：MPTP穿过血脑屏障,进入脑内后由胶质细胞内的单胺氧化酶-B(MA0-B)将其最终转化为具有神经毒性作用的1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)。美国一个专利(USA, US7629374B2, use of aminoindazole derivatives for the inhibition of tau phosphorylation)已经表明氨基吲唑衍生物可以抑制tau蛋白的磷酸化,但是并没有明确的阐明具体哪些化合物具有tau蛋白磷酸化抑制作用。基于相似结构化合物可能具有相似药效的原理,我们筛选了一系列可能具有tau蛋白磷酸化抑制作用的吲唑衍生物,幸运的发现了6-氨基-1-氢-吲唑。那么6-氨基-1-氢-吲唑对PD体内外多巴胺神经元是否均具有保护作用呢?其保护程度如何呢?其发挥神经元保护作用的分子机制是否与抑制tau蛋白过磷酸化有关呢?基于这些问题,本课题开展了一系列研究。方法本研究以MPP+诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡建立PD体外细胞模型,以C57BL小鼠腹腔注射MPTP,建立PD整体动物模型,以二者为研究对象。体外实验：以MTT法检测6-氨基-1-氢吲唑预处理对MPP+诱导凋亡的SH-SY5Y神经细胞存活率的影响；以酪氨酸羟化酶(TH)的免疫细胞化学染色法检测6-氨基-1-氢-吲唑预处理对MPP+诱导凋亡的多巴胺神经细胞的保护作用；以Hoechst33258核染研究6-氨基-1-氢-吲唑预处理对MPP+诱导凋亡细胞的核形态的影响。体内实验：以观察PD症状实验检测6-氨基-1-氢-吲唑预处理对PD症状潜伏期和持续期的影响；以酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学染色法检测6-氨基-1-氢-吲唑预处理对PD小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的保护作用；以HPLC法检测6-氨基-1-氢-吲唑预处理对PD小鼠纹状体内多巴胺含量的影响；以行为学实验检测6-氨基-1-氢-吲唑预处理对PD小鼠行为学损伤的作用。机制研究：以Westen blot技术以及荧光双染色方法初步探讨6-氨基-1-氢-吲唑预处理对PD模型多巴胺神经元保护作用的分子机制。结果以MPP+诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡成功建立体外PD细胞模型,探索6-氨基-1-氢-吲唑对体外多巴胺能神经元的保护作用。首先,0-1500 μM MPP+作用于SH-SY5Y细胞24-72h,寻找最适宜造模浓度以及时间。实验结果显示：SH-SY5Y神经细胞的存活率随着MPP+浓度增加而逐渐减小,在1000 μM MPP+处理细胞72h时,细胞存活率降低为空白对照组的50%左右,且随着浓度增加,细胞存活率不再明显下降,因此选定1000 μM MPP+作用SH-SY5Y细胞72h作为造模条件。我们进一步将0-200 μM不同浓度的6-氨基-1-氢-吲唑单独作用于SH-SY5Y神经细胞。结果显示：0-100 μM 6-氨基-1-氢-吲唑本身对细胞存活率的影响没有统计学意义,而200 μM 6-氨基-1-氢-吲唑明显降低细胞的存活率。在加入1000 μM MPP+前,0-200 μM不同浓度的6-氨基-1-氢-吲唑提前预处理SH-SY5Y神经细胞2h。与MPP+组相比,药物组细胞存活率明显提高,且在100μ M时,细胞存活率约为空白对照组的96%。我们进一步应用TH免疫细胞化学染色检测残余多巴胺神经细胞的数量和形态,结果显示：MPP+能诱导多巴胺神经细胞大量丢失,细胞体积减小；而100 μM 6-氨基-1-氢-吲唑预处理2h后,TH阳性细胞数明显增多,细胞体积增大。我们通过Hoechst 33258核染进一步发现6-氨基-1-氢-吲唑具有抗神经元凋亡作用。对照组正常细胞核呈现弥散均匀分布,而MPP+处理后的凋亡细胞核呈现浓染、碎裂、聚集等凋亡形态,而6-氨基-1-氢-吲唑能明显减轻MPP+诱导的上述细胞核凋亡状态。在体内实验中,首先我们成功制备了MPTP PD动物模型,进一步观察6-氨基-1-氢-吲唑预处理对PD小鼠多巴胺能神经元的作用以及MPTP对PD小鼠行为学损伤的影响。在记录MPTP注射后PD小鼠出现震颤麻痹等PD症状的潜伏期以及持续时间的试验中,我们发现：与空白组相比,MPTP组小鼠PD症状较为明显,具有较短的PD潜伏期(1.62±0.11 min)以及较长的PD持续期(21.86+0.21min)。6-氨基-1-氢-吲唑预处理后,能够明显的延长PD小鼠的潜伏期(5 mg/kg 6-氨基-1-氢-吲唑处理组：4.55±0.14 min;7 mg/kg 6-氨基-1-氢-吲唑处理组：3.82±0.20 min),缩短持续期(5 mg/kg6-氨基-1-氢-吲唑处理组：13.18±0.27min; 7 mg/kg6-氨基-1-氢-吲唑处理组：18.00±0.34 min),并且PD症状减轻。对中脑黑质致密部进行TH免疫组织化学染色后发现,神经毒剂MPTP可导致多巴胺神经元数目明显减少；而6-氨基-1-氢-吲唑预处理后,多巴胺神经元数目较MPTP组明显增加。进一步以HPLC法分析纹状体多巴胺含量发现,相比于MPTP模型组,药物组能够明显提高纹状体多巴胺含量。我们通过爬杆与牵引实验对PD小鼠进行行为学检测。在爬杆试验中我们发现,相比于MPTP模型组小鼠的动作迟缓,药物组小鼠完成指定动作需要更少的时间,获得较高的分数；在牵引实验中,空白对照组小鼠表现灵活,基本都能够用四肢抓住电线,而MPTP可导致小鼠后肢无力,因此,MPTP模型组只能用两个前肢抓住电线,或者直接掉落。而6-氨基-1-氢-吲唑处理组小鼠的后肢无力症状明显改善,至少能用一只或者两只后肢抓住电线,评分增高。在上述试验中发现,相对于高剂量组药物(7 mg/kg6-氨基-1-氢-吲唑)而言,低剂量药物组(5 mg/kg6-氨基-1-氢-吲唑)呈现较好的多巴胺神经元保护作用以及抗行为学损伤作用。我们通过Western blot以及免疫荧光双染色法检测6-氨基-1-氢吲唑在体内外发挥多巴胺神经元保护作用的分子机制。在细胞Western blot分析中发现,MPP+引起tau蛋白的过磷酸化,并且在作用8h时,表达最明显,而100 gM 6-氨基-1-氢-吲唑预处理能明显降低MPP+引起的tau蛋白过磷酸化水平。在荧光双染色实验中我们发现：空白组TH表达明显,磷酸化tau蛋白表达较弱,而MPTP造模组磷酸化tau蛋白在多巴胺神经元中的表达明显增高,并且多巴胺神经元数目减少。低剂量药物组(5 mg/kg6-氨基-1-氢-吲唑)中磷酸化tau蛋白在多巴胺神经元中的表达明显降低。上述实验结果表明：6-氨基-1-氢-吲唑神经保护作用的发挥可能与抑制tau蛋白磷酸化有关。结论1.6-氨基-1-氢-吲唑对MPP+诱导凋亡的SH-SY5Y神经细胞具有保护性干预作用2.6-氨基-1-氢-吲唑对MPTP诱导PD动物模型的黑质多巴胺神经元凋亡具有保护性作用,并且提高纹状体多巴胺浓度以及改善PD小鼠行为学损伤3.MPP+/MPTP可引起体内、外PD模型中tau蛋白异常磷酸化,而6-氨基-1-氢-吲唑明显抑制与神经元凋亡密切相关的磷酸化tau蛋白的表达总而言之,本课题综合运用分子生物学、形态学、生物化学以及行为学等多种研究方法,首次证实6-氨基-1-氢-吲唑对帕金森病多巴胺神经元具有保护作用,并且初步探讨了其发挥神经保护作用的分子机制与抑制tau蛋白磷酸化有关。上述研究为6-氨基-1-氢-吲唑在其他神经退行性疾病中的研究以及今后的临床应用奠定了基础。