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大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上最重要的饲粮兼用作物之一,可作为植物蛋白最主要来源之一。我国南方是春大豆生产的重要区域,然而在春大豆种子发育成熟时期(R6或R7期),该地区常处于高温、多雨、高湿的季节(6月底至8月初),再加上大豆籽粒大,蛋白、脂肪和水分含量高,导致种子田间劣变严重,种子活力下降。胚胎晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白)广泛存在于高等植物发育的种子中,具有结合金属离子、清除活性氧自由基、保护酶活性与增强植物耐脱水能力等功能。Δ12-脂肪酸脱氢酶(delta 12fatty acid desaturases,FAD2)在十字花科的几个种中都有分布,在多种高等植物中已证明,该酶通过调控不饱和脂肪酸的合成从而使生物膜适应温度胁迫。种子成熟蛋白(seed maturation protein,PM27)是一类与种子成熟相关的蛋白,它是与种子活力相关的miR164c的潜在靶基因之一。本实验室前期研究发现GmCDPKSK5与高温高湿胁迫下春大豆种子活力的形成相关。通过构建高温高湿胁迫下抗种子田间劣变春大豆种子膜蛋白酵母双杂交文库,以GmCDPKSK5为诱饵筛选在细胞膜上与之互作的蛋白,初步确定了与之互作的蛋白GmLEA、GmFAD2-1B与GmPM27。在此基础上本研究做了以下研究:(1)GmLEA、GmFAD2-1B 与 GmPM27 三个蛋白与 GmCDPKSK5 互作的验证;(2)GmLEA、GmFAD2-1B与GmPM27基因的分离及其编码蛋白亚细胞定位;(3)GmLEA、GmFAD2-1B与GmPM27三个基因在不同种子田间劣变抗性大豆种质种子中的表达模式分析;(4)GmLEA和GmFAD2-1B过表达对拟南芥种子活力的影响。以期为进一步深入研究GmLEA、GmFAD2-1B与GmPM27基因在参与大豆种子活力形成和响应非生物胁迫等方面奠定基础。研究结果如下:1.酵母双杂交回转验证结果表明:GmCDPKSK5分别与GmLEA、GmFAD2-1B、GmPM27在酵母体内存在特异性互作,双分子荧光互补(BiFC)实验证明:GmLEA、GmFAD2-1B、GmPM27三个蛋白与GmCDPKSK5均在烟草叶片细胞的细胞膜上特异性互作。2.GmLEA基因的cDNA序列包含一个长1377 bp的开放阅读框(ORF),DNA序列长度为1879 bp,并且由两个外显子和一个内含子组成,该基因所编码的蛋白定位在烟草叶片细胞的细胞膜上;GmFAD2-1B基因的cDNA序列包含一个长1164 bp的ORF,DNA序列长1164bp,该基因没有内含子,该基因编码的蛋白定位在烟草叶片细胞的细胞膜上;GmPM27基因的cDNA序列包含一个长1020 bp的ORF,DNA序列长1135bp,并且由两个外显子和一个内含子组成,该基因编码的蛋白定位在烟草叶片细胞的细胞膜和细胞核上。3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:在湘豆3号和宁镇1号种子中GmLEA基因主要在成熟的种子中表达,在湘豆3号种子发育过程中GmLEA基因表达量呈先上升后下降的趋势,并且在开花后50天达到最大值,在宁镇1号种子发育过程中GmLEA基因表达量呈上升的趋势,并且在开花后60天达到最大值;高温高湿胁迫后,与对照相比,GmLEA基因在湘豆3号中96 h时下调表达,其余时间点均上调表达,在宁镇1号中,在24h处下调表达;在湘豆3号和宁镇1号种子中GmFAD2-1B基因主要在成熟的种子中表达,在种子发育过程中GmFAD2-1B基因表达量呈先上升后下降的趋势,并且在开花后20天达到最大值;高温高湿胁迫后,与对照相比,在湘豆3号中,GmFAD2-1B在各个时间点均上调表达;在宁镇1号中GmFAD2-1B在24h和168 h上调表达,在48 h和96 h下调表达;在湘豆3号和宁镇1号种子中GmPM27基因主要在成熟的种子中表达,在种子发育过程中GmPM27基因表达量呈先上升后下降的趋势,并且在开花后50天达到最大值;高温高湿胁迫后,与对照相比,在湘豆3号中,GmPM27在24 h、96 h和168 h是上调表达;在宁镇1号中,GmPM27各个时间点均上调表达,但是,GmPM27在湘豆种子中的表达量远远高于宁镇1号种子中的表达量。实验结果发现这三个基因在高温高湿胁迫前后的大豆种子中差异表达,推测其参与高温高湿胁迫下种子活力的形成。4.高温高湿胁迫后,与对照相比,WT、pBI121-GUS过表达、GmLEA过表达和GmFAD2-1B过表达拟南芥植株的发芽率、发芽势和发芽指数均发生了下降,但是GmLEA过表达和GmFAD2-1B过表达拟南芥植株的情况要好于其他两个;平均发茅天数较对照组有所提高,GmLEA过表达和GmFAD2-1B过表达拟南芥植株的平均发茅天数较WT、pBI121-GUS过表达种子低;可以证明GmLEA过表达和GmFAD2-1B过表达拟南芥植株的种子活力高于WT和pBI121-GUS过表达拟南芥植株。说明GmLEA和GmF.4D2-1B可以提高拟南芥种子活力。