背景： 随着人口的老龄化，脑梗死的发病率越来越高，其危害性表现为高致死和致残率。目前最有效的药物治疗方法溶栓治疗，由于需具备十分严格的适应症以及潜在的风险(如颅内出血)而只能在极少数病人中得到开展。缺血半暗带是脑梗死治疗的主要靶点。然而，如何确定缺血半暗带以及脑梗塞亚急性是否仍然存在半暗带，医学上一直难有明确的定论。 乏氧组织显像是近几年来应用于缺血半暗带研究的一种新的方法。乏氧组织是指氧浓度介于正常与无氧之间、且功能异常而尚无明显形态学改变的组织，与缺血半暗带的概念十分接近。经典的观点认为缺血半暗带最多只能存在40h左右，而乏氧方面的实验研究也基本都是研究缺血24h内的乏氧情况。但是，临床方面的乏氧研究却发现乏氧组织有可能在脑梗死发生后长期存在，而我们在之前的临床研究中发现一例患者在发病44d后，仍然存在乏氧组织。因此乏氧组织是否真的能长期存在，如果能，为何有些患者存在，有些患者没有？而这些脑梗死后期的乏氧组织究竟以什么机制持续存在着，是否与血管的增生或分布有关？ 基于以上的理论和疑问，本实验拟通过动物实验探索乏氧组织的存在时间长短是否与再灌注的时间点有关，并且进一步研究脑梗死后期的乏氧组织与血管增生的关系。 第一章：大鼠脑梗死后乏氧组织的动态变化 一、目的： 1.分别利用放射自显影和免疫荧光法探索乏氧组织的持续时间是否与缺血灌注时间点有关，并筛选出哪个缺血时间点再灌注的大脑中动脉闭塞(MCAO)模型可以长期存在乏氧组织(≥14d)。 2.研究不同缺血再灌注时间点的MCAO模型其乏氧组织的动态变化如何。 二、方法： 1、实验动物： 健康成年雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠120只，清洁级，体重280～330g，人工昼夜节律饲养。 2、缺血再灌注模型的制作： 参照Longer氏法，稍加改良。到缺血预定时间点后，将栓线拉回到颈外动脉的主干中，从而实现再灌注。持续缺血组不拔线。假手术组不插线，其余操作同上。 3、实验分组： 分为持续缺血组(PI)、1.5h缺血再灌注组(1.5hIR)、2h缺血再灌注组(2hIR)和3h缺血再灌注组(3hIR)，放射自显影部分每组再分为术后1d和术后14d2个亚组；免疫荧光部分每组再分为术后1d、3d、7d、14d、21d和28d亚组。每个亚组3只大鼠。脑梗死模型制作不成功或者未生存至预定时间点或者并发脑出血(包括蛛网膜下腔出血)者均不算入分组例数内。 4、放射自显影： 每只大鼠以99mTc—HL91185MBq/0.5ml由股静脉注入。4h后处死动物并迅速开颅取脑、冰冻切片；以接触法曝光24h，最后显影、定影处理。结束后标本行HE染色，以定位乏氧组织。 5、EF5给药及标本处理： 即配的EF5溶液以3mg/100g体重的剂量通过尾静脉注射进大鼠体内。4h后行心脏灌注、开颅取脑，标本先以4％多聚甲醛固定6h，再经梯度蔗糖脱水处理，最后行冰冻切片。 6、免疫荧光法乏氧显像 分常规染色组和EF5竞争对照染色组：常规染色组一抗为Cy3标记的ELK3-51(75ug/ml)；EF5竞争对照染色组用Cy3-ELK3-51 competed溶液代替Cy3-ELK3-51，用以判断假阳性。空白对照组不加抗体，以PBS代替。 7、HE染色： 染色过程按标准HE染色法(过程略)。 8、TTC染色： 取部分大脑组织行该项染色，以确定脑梗死。取厚约1～2mm厚的冠状切面的脑组织(不固定)，加入2％TTC溶液约30ml，避光、37℃孵育30min。 9、组织分区： 为方便统一在荧光显微镜下观察乏氧组织，拟将每张组织切片的缺血侧大脑半球的周围皮质区分为4个区，依次分为A、B、C和D区(图1)，显微镜下均以×200的倍数对每个区域进行观察。 10、图像分析： 利用Image Pro Plus6.0专业图形分析软件对图像进行累积光密度(IOD SUM)和乏氧组织面积(Area SUM)的测量。 11、统计学分析： 采用SPSS for Windows Ver.11.5统计软件包对数据进行统计学处理。结果用(-X±s)表示，P<0.05认为有统计学差异。 三、结果： 1、模型成功率和死亡率： 模型成功率(术后出现瘫痪且开颅排除并发脑出血—图2)约为80％。1.5hIR组死亡率最低，3d内为10％左右，7d内为20％，7d后很少死亡。PI组死亡率最高，14d内约为50％。 2、放射自显影(图3): 1.5hIR组术后1d和14d亚组均为乏氧阳性，乏氧组织呈条片状，位于梗死侧大脑半球的周围皮质区，其余各组术后1天和14天均为乏氧阴性。 3、乏氧组织的动态变化(图4): 与放射自显影的结果相似，1.5hIR组的乏氧组织持续时间最长，一直持续至术后14d。而其余各组的乏氧组织均只持续至术后3d。乏氧组织成片状或条状，多位于梗死侧大脑半球的外侧周围皮质，以A区和B区多见。 各组乏氧组织的面积和平均光密度随着时间的延长而逐渐缩小和减弱，但1.5hIR和PI组内各亚组的平均光密度没有减弱(P=0.075和P=0.126)。各组1d时的乏氧面积和平均光密度没有明显差异(P=0.844和P=0.536)；而3d时3hIR组的乏氧面积和平均光密度最小(P=0.023和P=0.007)，其余组之间却没有明显差异(P=0.662和P=0.153)。 四、结论： 1、脑梗死后乏氧组织可以长期存在(≥14d)，但与再灌注时间点有关；1.5hIR组的缺血侧大脑半球周围皮层长期处于乏氧状态。 2、随着发病时间的延长，乏氧组织逐渐消失，可能存活下来或死亡。 3、缺血2h或以上与持续缺血差不多，均可使脑组织乏氧状态很快消失(≤3天)。 4、1.5hIR的MCAO模型是研究脑梗死后长期存在的乏氧组织的合适模型。 第二章：大鼠脑梗死后乏氧组织动态变化的血管机制 一、目的： 1.探索乏氧组织的分布与微血管分布的关系； 2.研究脑梗死后乏氧组织的动态变化与微血管增生的关系。 3.研究脑梗死后乏氧组织的持续时间与微血管密度(MVD)的关系。 二、方法： 1、实验动物： 健康成年雄性SD大鼠33只，体重280～330g，清洁级，人工昼夜节律饲养。 2、缺血再灌注模型的制作： 同第一章。 3、实验分组： 分3组：1.5hIR组、PI组和假手术组(S组)；1.5hIR组和PI组再分术后3d、7d、14d三个亚组，每个亚组5只大鼠。5组共3只大鼠。 4、乏氧组织和血管内皮细胞的免疫荧光双标： 对1.5hIR组和PI组进行免疫荧光双染。用序贯法染色。先染血管内皮细胞，先后以一抗(vWF)、二抗孵育后，4％多聚甲醛室温固定20min；ttPBS和PBS泡洗，再以10％山羊血清室温封闭1小时，ttPBS和PBS泡；最后Cy3-ELK3-51避光、4度孵育过夜，50％甘油封片。对S组则单染血管内皮细胞。 5、组织分区： 将乏氧组织常出现的周围皮层分为A、B和C三个区(图7)。 6、图像分析及MVD计算方法： 利用Adobe Photoshop CS2专业图形分析软件对A组双标的乏氧图片和血管图片进行重叠(图层合并)。利用Image Pro Plus6.0专业图像分析软件对血管图片进行微血管数目计算。图片中每个独立的点状或条状或成簇的绿色荧光图像，记为一个微血管；有明显厚肌层的血管不予计算。每张图片的面积记为一个单位面积，则该图片的微血管数即代表MVD。将每张切片A、B、C区的微血管数目的平均值作为该切片的MVD，而对同一亚组所有切片的MVD进行统计平均作为该亚组的MVD。乏氧组织内部(或周围区域)的MVD计算依照上述方法按所占比较计算获得。 7、统计学分析： 采用SPSS for Windows Ver.11.5统计软件包对数据进行统计学处理。结果用(X±s)表示，P<0.05认为有统计学差异。 三、结果： 1、1.5hIR组各亚组的乏氧组织内部MVD均比外周MVD小；随着时间延长，乏氧组织内部和外周MVD均有增高趋势，但内部MVD相邻时间点之间没有统计学差异(P=0.140和P=0.072)；而外周MVD3d和7d没有统计学差异(P=0.513)，但14d明显高于7d(P=0.012)。 2、随着时间的延长，1.5hIR组和PI组的缺血侧皮层组织的MVD均逐渐增高。 3.1.5hIR组与PI组3d时的皮层MVD没有统计学差异(P=0.719)；而7d和14d时1.5hIR组均明显高于PI组(均P<0.001)，S组皮层MVD最低(78.88±6.50)。 四、结论： 1、乏氧组织多出现在血管密度较低的区域。 2、缺血时间不同导致的乏氧组织持续时间不同，与各自缺血侧皮质的微血管增生程度不同有关。脑梗