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研究背景类风湿关节炎（RA）是一种累及全身多个组织和脏器的慢性、炎症性疾病。主要病理过程是滑膜受累导致滑膜炎症,引起骨和软骨的损伤,最后发展为关节畸形和关节强直。RA也可以产生全身性弥漫性炎症,包括肺间质的改变、心包、胸膜、巩膜的受累,以及常见的皮下组织的皮肤结节。虽然RA的发病机制尚未完全阐明,但自身免疫在RA发病机制、发生和发展中发挥的关键作用已经得到广泛的认可。RA在全世界的发病率约为1%,女性与男性的比例为3:1。所有年龄均可发病,最常见的发病年龄40岁到50岁。RA是主要的致残性疾病之一,造成关节活动功能的丧失,给社会和家庭带来巨大的压力和负担。在RA的发病机制中,在免疫基因易感宿主的自身抗原诱导活化的T细胞发挥着重要的作用。T细胞活化后导致多种免疫效应,包括滑膜细胞的增殖,内皮细胞的活化。骨髓和外周血中前炎症细胞活化,巨噬细胞、成纤维样滑膜细胞、B细胞分泌大量的细胞因子和自身抗体。树突状细胞（DC）是体内功能最为强大的抗原提呈细胞,是唯一可以激活初始T细胞的抗原提呈细胞。DC起源于骨髓干细胞,平时寄居在组织和外周血中。外周组织中的DC识别抗原后在细胞因子的刺激下逐渐分化,高表达MHC分子和协同刺激分子,在向次级淋巴器官迁移的过程中逐渐成熟,而后在淋巴器官中与T细胞结合,刺激其活化或诱导其耐受。研究表明,RA患者滑膜和关节中浸润的T细胞周围可见成熟的DC。这些DC高表达MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86以及DC-SIGN等粘附分子和趋化因子受体,对T细胞的活化和组织的损伤起着重要作用。RA属祖国传统医学痹证范畴。痹证的分类,按病因可分为风痹、寒痹、湿痹、热痹、风湿热痹等;从病理特点可分为行痹、痛痹、着痹。痹证的发生主要是由于正气不足,感受风、寒、湿、热之邪所致。内因是基础,素体虚弱、正气不足、腠理不密、卫外不固,是引起痹证的内在因素,如再感受外邪,使肌肉、关节、经络痹阻而形成痹证。痹证的治疗以祛风通络为基本大法,首先应辨明寒热,治以祛风、除湿、舒筋活络,随其寒热而兼行清热或祛寒。对于病程日久,气血损伤,脏腑亏虚的痹证患者,应配合运用补益之法。青藤碱是中药清风藤的单体提取物,用于治疗RA已经有2000年的历史。研究发现青藤碱有抗炎、抗风湿的药理作用。尽管青藤碱广泛的药理作用已经得到阐明,但其作用机制,尤其是免疫抑制的机理尚有待进一步研究。为了进一步阐明青藤碱的药理作用,探讨其免疫抑制和RA的机理,本课题观察了青藤碱对RA患者DC趋化因子及其受体表达的影响和机制。目的:1.观察RA患者DC表面趋化因子受体的表达,研究DC表面趋化因子受体与RA患者疾病活动的相关关系;2.建立DC趋化因子及其受体的荧光定量PCR检测体系;3.观察青藤碱对RA患者DC趋化因子及其受体表达的影响;4.观察青藤碱对RA患者DC泛素和E3连接酶表达的影响;5.揭示青藤碱免疫抑制的机理,为青藤碱治疗RA提供理论和实验依据。方法:1.人外周血DC体外培养体系的建立根据课题组已经建立的方法,分离人外周血单核细胞,RPMI-1640完全培养基培养,采用GM-CSF和IL-4联合刺激,于培养第8天收获。2.DC表面趋化因子受体与RA患者疾病活动性的关系选取28名RA患者和10名正常健康人分为四组:正常组、低活动组、中活动组和高活动组。采用流式细胞仪检测RA患者DC表面CCR5和CCR7的表达,收集患者类风湿因子（RF）、C反应蛋白（CRP）和抗CCP抗体。采用直线相关分析CCR5、CCR7和RA患者疾病活动指标的相关关系。3.青藤碱对RA患者外周血DC趋化因子及其受体表达的影响采用1mM,2mM,5mM青藤碱溶液和空白对照溶液干预DC 12h。收集干预后的细胞提取DC总RNA并逆转录为cDNA。PCR扩增CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11和GAPDH cDNA片段,回收并纯化PCR产物。将CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11和GAPDH的PCR产物分别按108,107,106,105,104copies/μl梯度倍比稀释,荧光定量PCR仪检测并自动计算出样品的定量结果,描绘标准曲线。将各样本cDNA按照建立体系中的反应条件在荧光定量PCR仪上进行扩增,由电脑自动分析并计算出反应体系中待测样品cDNA达到设定阈值的循环数（Ct值）。以公式2-△△t计算出相对于空白对照组的青藤碱干预各组的DC中CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11和GAPDH mRNA的表达水平。收集DC培养上清,检测经不同浓度青藤碱干预后DC培养上清中CXCL9、CXCL10、CXCL11的表达。4.青藤碱对RA患者外周血DC中泛素和E3表达的影响收集青藤碱干预后的RA患者外周血DC,提取DC总RNA和蛋白。Real timePCR检测DC中泛素和E3连接酶mRNA的表达,western-blotting检测青藤碱对RA患者DC中泛素和E3连接酶表达的影响。5.统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,结果以（?）±S表示,多组间均数比较采用One way-ANOVA,多个组分别与对照组比较采用Dunnett检验;连续变量间的直线相关采用Pearson相关分析,P<0.05为有统计学意义。结果:1.在GM-CSF和IL-4联合刺激的作用下,单核细胞成功的分化为DC。在光镜和电镜下观察可见其呈现典型的树突状形态,与对照组相比,RA低、中、高活动组患者CCR5（F=107.53,P=0.000）和CCR7（F=46.283,P=0.000）表达较高。2.在低疾病活动组（RF,r=0.775,P=0.014;CRP,r=0.802,P=0.009）、中疾病活动组（RF,r=0.0854,P=0.002;CRP,r=0.818,P=0.004）、高疾病活动组（RF,r=0.773,P=0.015;CRP,r=0.699,P=0.036）表达在RA患者DC表面CCR5与RF和CRP存在直线相关关系,相关性有统计学意义;与CCR5相似,在低疾病活动组（RF,1=0.754,P=0.019;CRP,r=0.968,P=0.000）、中疾病活动组（RF,r=0.0854,P=0.002;CRP,r=0.949,P=0.000）、高疾病活动组（RF,r=0.938,P=0.000;CRP,r=0.968,P=0.000）表达在RA患者DC表面CCR7与RF和CRP存在直线相关关系,相关性有统计学意义。3.流式细胞结果显示,青藤碱干预后DC表面CCR5（F=89.236,P=0.000）和CCR7（F=94.731,P=0.000）表达有显著差异,差异有统计学意义;与空白对照组相比,2mM、5mM sinomenine干预后DC表面CCR5和CCR7（P<0.05 or P<0.01）表达显著降低,差异有统计学意义;GAPDH、CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11阳性梯度定量模板数与Ct值关系对数拟合作图,得到不同梯度定量模板的对数值与循环数（Ct值）之间关系的标准曲线,分别有着非常好的相关关系（0.9943、0.9955、0.9926、0.9981、0.9938、0.9994）。荧光定量PCR检测结果显示,与空白对照相比,经2mM和5mM青藤碱干预后的DC中CCR5、CCR7、CXCL9、CXCL10、CXCL11 mRNA表达均有所有降低（P<0.05 or P<0.01）;ELISA结果显示,与空白对照相比,经青藤碱干预后的DC培养上清中CXCL9、CXCL10、CXCL11差异有统计学意义。4.荧光定量PCR结果显示,青藤碱4个剂量组之间RA患者外周血DC中泛素（F=41.222,P=0.000）、E3连接酶（F=59.657,P=0.000）mRNA表达有显著性差异;与空白对照组相比,经2mM和5mM青藤碱干预后DC中泛素和E3连接酶表达显著降低;Western-blot检测结果显示,经青藤碱干预后4组泛素和E3连接酶的表达均有所改变,差异有统计学意义。结论:1.建立了RA患者外周血树突状细胞趋化因子受体检测体系;2.不同疾病活动情况下RA患者DC表面趋化因子受体的表达与RA患者疾病活动指标存在直线相关关系,DC表面CCR5和CCR7可能是监测RA患者疾病活动和治疗效果的有效指标;3.青藤碱可有效抑制RA患者DC趋化因子及其受体的表达,青藤碱的免疫抑制机理可能与抑制DC的迁移有关,青藤碱可能通过抑制DC迁移到次级淋巴器官与T细胞结合,从而达到治疗RA的作用;4.青藤碱可能抑制泛素-蛋白酶体中重要蛋白的表达,抑制了泛素-蛋白酶体的功能,降低了NF-（?）B途径的磷酸化,从而影响了DC的免疫功能,达到免疫抑制的效果。