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目的:
1、研究重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)对HUVEC和J774A.1细胞的细胞毒性作用。
2、研究膜胆固醇对重组创伤弧菌溶细胞素活性的影响。
3、为探索天然创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)的细胞毒性分子机制提供一些实验依据。
方法:
1、诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白rVvhA,应用三步洗涤结合Ni2+亲和层析方法对rVvhA进行纯化,利用稀释复性加分步透析相结合的方法进行蛋白质复性。
2、复性后rVvhA作用于HUVEC和J774A.1细胞,MTT测定细胞存活率。在rVvhA作用前,HUVEC和J774A.1细胞先经MβCD预处理降低膜上胆固醇含量,待rVvhA作用HUVEC和J774A.1细胞8h后,MTT测定细胞的存活率；Fluo-3 AM钙离子荧光探针结合激光扫描共聚焦显微镜测定rVvhA作用细胞瞬间胞内钙离子浓度变化情况；测定细胞培养上清中的钾离子和乳酸脱氢酶浓度；流式细胞仪测定细胞凋亡和坏死率。
结果:
1、含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌经0.5 mmol/L IPTG诱导后表达的融合蛋白Mr约为54 kDa,电泳结果与该融合蛋白的理论推算值基本相符。表达的蛋白质经三步洗涤与Ni2+-NTA柱纯化后,其纯度达90.0％左右。纯化的rVvhA稀释复性后证明具有溶血活性。
2、rVvhA作用HUVEC和J774A.1细胞可抑制细胞增殖,降低细胞的存活率,且呈剂量依赖性。rVvhA作用后细胞内钙离子浓度增加,培养上清中钾离子浓度和乳酸脱氢酶活性也增加。流式测定结果可见1.0 HU/ml和2.0 HU/ml rVvhm可分别诱导J774A.1和HUVEC细胞发生明显凋亡,凋亡率分别为(13.5±2.14)％和(14.8±2.3)％。2.0 HU/ml和3.0 HU/ml rVvhA可分别诱导J774A.1和HUVEC细胞发生明显坏死。MβCD预处理可以减少细胞膜上胆固醇含量,且5mM MβCD作用HUVEC和J774A.1细胞30min没有细胞毒性。比较MβCD预处理组与rVvhA直接作用组,可见前者细胞存活率明显增加,rVvhA引起的钙离子内流、钾离子和乳酸脱氢酶释放均受到不同程度的抑制,rVvhA诱导的细胞凋亡及坏死也受到抑制。
结论:
rVvhA对HUVEC和J774A.1细胞有细胞毒性作用,抑制细胞增殖,且呈剂量依赖性；可以引起细胞内乳酸脱氢酶释放。rVvhA作用细胞可引起钙离子内流和钾离子释放,可以诱导细胞发生凋亡和坏死。rVvhA对经MβCD处理降低膜上胆固醇含量的细胞的作用较未处理组明显降低,提示rVvhA活性的发挥依赖膜上胆固醇的存在。