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神经系统损伤过程中,神经元会发生凋亡,而凋亡可能是神经元死亡的一种主要方式。在创伤性脑损伤动物模型中,可见神经元凋亡现象。在颅脑损伤患者的挫伤脑组织中有凋亡细胞的存在。通过对实验动物神经系统损伤模型的研究表明,神经元内存在凋亡和抗凋亡双重信号的激活,其中Caspase家族的半胱氨酸蛋白酶的激活是重要组成部分。 纳洛酮作为内源性阿片受体阻断剂,可通过一系列病理生理机制,包括稳定溶酶体膜、改善微循环、降低内皮素和肿瘤坏死因子水平等作用,从而起到保护神经细胞的作用,但纳洛酮对脑损伤后神经细胞凋亡的影响及纳洛酮抗脑外伤后神经细胞凋亡的分子机制和信号传导国内报道较少。 本研究选用健康普通家兔随机分成正常组、对照组、大剂量组和小剂量组,分别予非致伤、致伤、致伤后大剂量纳洛酮腹腔注射和致伤后小剂量纳洛酮腹腔注射处理,应用分子生物学方法——脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测各组脑组织中细胞凋亡的数量,用免疫组织化学方法检测各组脑浙江大学硕士研究生学位论文组织中Caspase一3蛋白的表达情况,观察纳洛酮对实验性脑损伤后神经细胞凋亡和Caspase一3表达的影响,比较不同剂量用药效果的差异,探讨纳洛酮治疗脑外伤的依据和CasPase一3介导的信号传导机制。材料与方法 l、动物分组:选用健康家兔77只,称重后随机分为正常组、对照组、大剂量组和小剂量组,各组家兔依次为17只、20只、20只、20只,四组体重方差检验无显著性差异(P=0.6009)。 么模型制作:除正常组家兔外,其余家兔均经盐酸氯胺酮(50m叭g)腹腔麻醉,在冠状缝后5~,中线旁5~处钻一直径8~骨窗,采用改进的Feeney自由落体损伤装置进行打击,用609重的击锤从60cm处自由坠落冲击撞杆造成严重脑挫裂伤,打击深度6们n刀n。 玉动物处理:除正常组家兔外,对照组家兔致伤后2小时予生理盐水2ml腹腔注射,连续10天;大剂量组家兔致伤后2小时按0.3mg/Kg用量予纳洛酮腹腔注射3天,后用量改为0.lmg/Kg腹腔注射,连续7天;小剂量组家兔致伤后2小时按O.01mgiKg用量予纳洛酮腹腔注射,连续10天。 4、取材:分别于致伤打击后15天断头处死各组家兔,完整取出全脑。每只家兔均在致伤处和对侧大脑半球同样位置取大小为约1月xlcm3脑组织作为标本,常规石蜡包埋。 5、检测:采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞,采用SP法进行Caspase一3免疫组织化学染色。 6、观察记录:在olympUS一CH光学显微镜下观察TUNEL及CasPase一3免疫反应的结果,并计数,计算出平均阳性率(LI),数据用均数仕标准差(社‘)表不。 7、统计学处理:数据都采用带有SPSS/n .0的comPaq Pentium皿1000计算机进行分析,结果以(社‘)表示,采用方差分析,定P<0.05为显著性差异。浙江大学硕士研究生学位论文结果一、实验对象基本资料 在实验过程中,对照组、大剂量组和小剂量组中小部分家兔均因致伤后感染腹泻死亡,三组间死亡率没有显著性差异(尸二O,7296)。除去死亡家兔后,四组间体重没有显著性差异(P=0.3835)。二、严重颅脑损伤后细胞凋亡状态(TUNEL法结果) 本组实验结果显示,在正常组和大剂量组家兔脑组织中亦有TUNEL阳性细胞,但阳性细胞数较少。小剂量组和对照组家兔脑组织中,TUNEL阳性细胞数明显较多。致伤处或对侧处,正常组、大剂量组、小剂量组和对照组四组LI值两两比较,均有显著差异(P<0.05),LI值大小为:正常组<大剂量组<小剂量组<对照组(表2,图2)。三、严重颅脑损伤后Caspase一3表达情况 本组实验结果显示,在正常组和大剂量组家兔脑组织中亦有Caspase一3阳性细胞,但阳性细胞数较少。小剂量组和对照组家兔脑组织中,Caspase一3阳性细胞数明显较多。致伤处或对侧处,正常组、大剂量组、小剂量组和对照组四组LI值两两比较,均有显著差异(P<0 .05),LI值大小为:正常组<大剂量组</卜剂量组<对照组。结论(l)细胞凋亡参与了严重颅脑损伤后神经细胞病理改变过程;(2)严重颅脑损伤后CasPase一3酶的活性升高并介导神经细胞凋亡;(3)纳洛酮具有抑制严重颅脑损伤后神经细胞凋亡的作用:(引Caspase一3介导的信号传导机制可能参与了纳洛酮抗严重脑损伤后神经细 胞凋亡过程;(5)大剂量纳洛酮应用可以较显著抑制严重颅脑损伤后的神经细胞凋亡。