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临床研究表明,骨骼异常、创伤性损伤或肿瘤切除导致大面积骨缺损时,骨组织往往无法自我修复,这种缺陷通常采取自体或同种异体骨移植治疗。然而,供体有限,供体部位发病率和易引起免疫排斥等缺点使得自体和异体骨移植的临床应用受到限制。为了克服传统疗法的这些缺点,对探寻和开发可以替代自然骨的修复材料的要求越来越急切。将载体材料与活性因子结合后置入体内,诱导骨缺损部位产生新骨的骨组织工程得到人们极大的兴趣。骨诱导生长因子骨形态发生蛋白(BMP-2)具有诱导成骨细胞分化,促进骨形成的巨大能力。但是其体内半衰期仅有数分钟,易被体液稀释或酶解而失活,大剂量频繁给药会引起异位成骨、炎症反应等毒副作用。应用微球控制BMP-2的释放,可有效解决BMP-2半衰期短易失活的问题,延长其在缺损部位的作用时长,避免频繁给药给患者带来的痛苦。本课题以MPEG-PCL为载体材料,通过W1/O/W2复乳化法制备了包载BMP-2的BMP-2/MPEG-PCL缓释微球制剂,研究内容主要有:BMP-2/MPEG-PCL微球的制备及评价;BMP-2/MPEG-PCL微球的体外释药性及初步稳定性研究;BMP-2/MPEG-PCL微球的生物相容性及体内诱导异位成骨能力研究。主要研究方法与结果如下:1.BMP-2/MPEG-PCL微球的制备及评价采用W1/O/W2复乳化法制备BMP-2/MPEG-PCL微球,以包封率为评价指标,通过单因素及正交试验筛选最佳处方及制备工艺,结果表明最终处方及工艺为MPEG-PCL 浓度为 100mg/mL,PVA 浓度为 2%,W1:O(V/V)=1:5,O:W2(V/V)=1:12,剪切速度为10000r/min时,微球的包封率最高,为(80.96±1.01)%。对BMP-2/MPEG-PCL微球外观形态及理化性质进行评价,结果表明所制得的BMP-2/MPEG-PCL微球外观形态光滑圆整,具有良好的流动性,堆密度为(0.22±0.01)g/mL,表面滑动角(α)为(23.5±1.1)°,休止角(θ)为(36.84±1.84)°,粒径均匀,为(4.30±0.19)μm;Zeta 电势为-(23.63±2.31)mv,载药量为(0.089±0.001)%,可满足工业生产的要求。2.BMP-2/MPEG-PCL微球的体外释药性及初步稳定性研究通过半透膜透析法进行体外释药实验,用含0.2%叠氮化钠的pH7.4的磷酸盐缓冲液为释放介质,以BMP-2溶液为对照,测定不同时间点BMP-2溶液以及BMP-2/MPEG-PCL微球的体外释药情况,绘制释放曲线,然后对药物体外释放曲线进行数学模型拟合,考察BMP-2/MPEG-PCL微球的体外释药规律。通过高温、高湿和强光照影响因素试验研究BMP-2/MPEG-PCL微球制剂的初步稳定性。结果表明BMP-2溶液组在释放介质中释放十分迅速,仅7.5h的累积释放量就达到了(97.33±1.97)%,符合 Ritger-pep-pas 模型;而 BMP-2/MPEG-PCL 微球在释放介质中比较稳定,释放缓慢,第一天的累积释放量为(20.76±1.43)%,突释较小,第45天累积释放量为(96.61±2.73)%,具有显著缓释作用,符合Higuchi方程。影响因素实验结果显示微球制剂应当存放在低温、干燥、相对避光的环境中,才能保证其外观形态、粒径、含量等不会发生变化。3.BMP-2/MPEG-PCL微球的生物相容性及体内诱导异位成骨能力研究首先将C2C12细胞与BMP-2、BMP-2/MPEG-PCL微球、空白微球共同培养,采用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒CCK-8来检测细胞相对增殖度(RGR)。结果表明各时间点BMP-2组、空白微球组以及BMP-2/MPEG-PCL微球组的细胞相对增殖度相比于对照组,无显著差异(P>0.05),细胞毒性等级为0-Ⅰ级,无细胞毒性,符合国家标准。而各组与空白组比较有显著差异(P<0.05)。说明BMP-2、BMP-2/MPEG-PCL微球以及空白微球对C2C12细胞无明显毒副作用,具有良好的生物相容性。然后将BMP-2/MPEG-PCL微球和同剂量的BMP-2溶液分别植入昆明小鼠后腿肌袋内,分别于2周、4周和8周后进行平均骨密度测定、组织学检查、ALP活性测定、Ca2+含量测定等操作。结果表明BMP-2/MPEG-PCL微球和单纯植入BMP-2均可成功诱导出异位骨组织,但制剂组的新生骨大小、平均骨密度、ALP活性以及钙含量均高于BMP-2溶液组。证明BMP-2/MPEG-PCL微球不仅在活体内可以发挥载药作用,维持BMP-2活性,而且因其缓释效果,可表现出更强大的异位骨诱导活性,效果远好于BMP-2溶液组,达到了维持BMP-2作用时间,提高治疗效果的目的。本文制备了负载BMP-2的MPEG-PCL微球,通过处方和工艺筛选,所制得的BMP-2/MPEG-PCL微球外观圆整,粒径大小均匀;体外释放实验表现出显著的缓释效果;细胞毒性实验说明制剂无细胞毒性,具有良好的生物安全性;体内异位成骨实验说明制剂具有一定的诱导成骨活性。