水韭属（Isoetes L.）是水韭科（Isoeteceae）唯一幸存的属,起源于古老的石松类植物,是最早出现的维管植物类群之一,有着特殊的进化地位,能够适应一系列的生境类型。同时,也是最古老的具有景天酸代谢途径（CAM,Crassulacean Acid Metabolism）的植物类群,是水生CAM植物的典型代表。然而,关于水韭属植物的CAM代谢途径的起源与进化机制并不清楚。PEPC基因（phosphoenolpyruvate carboxylase gene）是编码CAM代谢途径关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）的基因,PEPC基因家族由多个成员组成,包括几个植物型PEPC和至少一个同源性较低的细菌型PEPC,在植物的光合作用碳固定、脂肪酸合成、植物抗逆性等方面起到重要作用。目前,有关植物PEPC基因的研究主要集中在陆生的C4和CAM植物,有关水生CAM植物PEPC基因的特征、功能及其进化等依然不清楚,需要进一步的研究。前期转录组学研究显示,中华水韭在夜间沉水状态下PEPC基因高度表达,从分子水平上验证了PEPC基因参与了水韭属植物的CAM途径的表达调控。本研究以中国特有种香格里拉水韭（Isoetes shangrilaensis X.Liu）为研究对象,克隆香格里拉水韭的PEPC基因（Is PEPC）,分析其序列特征、系统进化分型及蛋白结构与功能,并构建了转香格里拉水韭Is PEPC2基因拟南芥,主要结果如下:1.Is PEPC基因的分离与鉴定利用转录组数据分析及特异性引物扩增,从香格里拉水韭c DNA中分离克隆获得2个PEPC家族基因。这两个基因有PEPC家族基因典型结构特征,分别命名为Is PEPC2、Is PEPC4。运用NCBI的在线blast功能,分别对Is PEPC2、Is PEPC4的核苷酸、氨基酸序列进行同源性检索分析,结果显示Is PEPC2在核苷酸水平与被子植物门双子叶植物纲桃属植物扁桃的Pd PEPC2的同源性最高,在氨基酸水平与卷柏属植物江南卷柏的Sm PEPC2同源性最高;Is PEPC4在核苷酸及氨基酸水平均与卷柏属植物江南卷柏的Sm PEPC4同源性最高。2.Is PEPC基因的系统发育分型与适应性进化意义基于核苷酸序列的系统发育分析显示,香格里拉水韭的Is PEPC基因分为两类,分别位于两个分支,其中,Is PEPC2基因位于植物型PEPC基因分支,Is PEPC4基因位于细菌型PEPC基因分支,并都与江南卷柏的Sm PEPC基因亲缘关系最近,聚在各分支的基部,有着较早的起源历史。基于氨基酸序列的系统发育分析得到一致的结果。同时,植物型的Is PEPC2基因可能与CO2的固定有关,参与CAM光合作用途径,说明早期的PEPC基因就可能分化出与CO2固定相关的功能,并导致水韭属植物CAM途径的起源。而细菌型的Is PEPC4可能孢子形成与植物抗逆性有关。3.Is PEPC基因编码蛋白的结构特征与功能相关性Is PEPC2基因CDS编码区长度为2928bp,共编码975个氨基酸,蛋白分子量为110.69 k D,且N端存在比较保守的磷酸化区（Ser残基）;Is PEPC4基因CDS编码区长度为3060bp,共编码1019个氨基酸,蛋白分子量为115.26 k D,N端不存在比较保守的磷酸化区（Ser残基）。Is PEPC2、Is PEPC4蛋白理论等电点（PI）均为5.65,为带负电荷不稳定的亲水性蛋白。Is PEPC二级结构预测分析表明,2个Is PEPC蛋白均以α-螺旋为主,其次为无规则卷曲,而扩展链结构和β-转角所占比例较小。蛋白信号肽预测显示,2个Is PEPC蛋白均不存在信号肽酶切位点,无信号肽。跨膜区域分析结果显示,2个Is PEPC蛋白均无明显的跨膜区域。保守结构域分析发现Is PEPC2、Is PEPC4蛋白均存在PEPcase保守结构域,两个PEPC蛋白在C末端均为保守区域,Is PEPC2存在1个PEPcase保守结构域,Is PEPC4存在2个PEPcase保守结构域。保守基序分析发现Is PEPC2和Is PEPC4蛋白均存在10个保守基序,但保守基序的位置不同。进一步表明Is PEPC2基因为植物型PEPC、Is PEPC4基因为细菌型PEPC,结构域及保守基序的差异表明两个蛋白的功能不同。Is PEPC蛋白三级结构分析结果显示香格里拉水韭的Is PEPC2蛋白有193个α-螺旋、50个扩展链结构及288个β-转角,Is PEPC4蛋白有194个α-螺旋、59个扩展链结构及392个β-转角。Is PEPC2蛋白含有240个cys（半光氨酸）,Is PEPC4蛋白含有264个cys（半光氨酸）,但是均没有找到二硫键,两个Is PEPC蛋白均不包含钙离子结合位点、锌离子结合位点。同时,香格里拉水韭是水韭属水生CAM途径的代表植物,菠萝是凤梨科旱生CAM途径的代表植物。香格里拉水韭Is PEPC蛋白与菠萝的Ac PEPC蛋白相比,两者的保守结构域的位置和数目基本相同,但是蛋白的二级、三级结构存在一定的差异,且菠萝的Ac PEPC4蛋白丢失了基序10。这种差异,一方面可能与PEPC基因系统发育的进化历史有关,另一方面,可能与两者受到的环境选择压力不同有关。香格里拉水韭PEPC基因起源较早,编码的蛋白结构更保守,而且,拥有CAM代谢途径的类群都有着各自独立的进化历史,水生CAM植物和陆生CAM植物中,PEPC基因编码的蛋白结构与功能的进化相关性,还需要进一步研究。4.转Is PEPC2基因的过表达拟南芥通过酶切连接法,将Is PEPC2基因插入p CAMBIA-2300-N-e GFP及p MD质粒载体上。采用农杆菌介导的花序浸染法将两个重组载体分开转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选、g DNA水平鉴定、RNA水平鉴定,共获得T1代p C2300-N-e GFP-Is PEPC2转基因株系26个,p MD-Is PEPC2转基因株系32个,T3代p C2300-N-e GFP-Is PEPC2纯合过表达株系3个,p MD-Is PEPC2纯合过表达株系4个,亚细胞定位显示Is PEPC2基因定位在细胞膜上,为进一步研究水韭属植物PEPC基因的功能及表达机制提供了基础。