研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性高致残性自身免疫性疾病,以进展性、侵蚀性关节炎为主要表现。RA是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要疾病之一。目前类风湿关节炎的治疗主要包括非甾体抗炎药(non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)、改善病情抗风湿药(disease modifying antirheumatic drug, DMARDs)及生物制剂。虽经过正规早期联合多种DMARDs药物治疗,仍有部分RA患者疗效不佳；同时随着治疗的延长,药物疗效逐渐减弱,对治疗药物无反应或低反应,出现耐药现象,导致治疗失败。耐药尤其是多药耐药(Multiple Drug Resistance, MDR)的形成是影响RA治疗效果的重要因素。作为治疗失败的原因之一,MDR在肿瘤和感染性疾病的治疗中已得以足够重视,但在RA的治疗中的研究还较少。跨膜转运蛋白介导的细胞内药物排出增加,导致细胞内药物降低,是MDR的重要机制。P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是迄今为止研究的最多也是最重要的MDR相关的蛋白。它的作用底物广泛,在抗风湿药物中,目前已明确糖皮质激素、氯喹等是P-gp的底物。有研究报道难治性类风湿关节炎P-gp表达和活性增高,P-gp参与类风湿关节炎多药耐药的产生。TNF-α是RA发病机制中居中心地位的促炎症因子,参与RA复杂的细胞网络反应,其水平与疾病活动程度相关,并随疾病的缓解而降低。目前已证实TNF-α可影响多种细胞系P-gp的表达和活性,参与MDR的形成。但在RA中TNF-α是否影响P-gp的表达和活性,参与MDR的形成,国内外尚未见报道。本研究拟通过检测RA初治组、RA治疗有效组、RA难治组患者外周血单个核细胞P-gp表达和功能、TNF-αmRNA,血清TNF-α水平,对P-gp与类风湿关节炎多药耐药进行相关性研究,筛选RA耐药的分子标志,研究RA对DMARDs的耐药特征,分析P-gp与TNF-α及疾病活动的相关性。在此基础上,在体外实验中我们观察TNF-α对RA外周血单个核细胞P-gp的影响,探寻TNF-α对RA外周血单个核细胞P-gp的调控机制,从整体、细胞、胞内信号转导水平深入了解炎性因子TNF-α对RA P-gp的作用及RA多药耐药的影响。这一研究将为我们更深入了解RA多药耐药的特征及形成机制提供理论基础,并进一步探寻预防和逆转耐药的方法和途径,给类风湿关节炎的治疗带来新的突破。第一部分P-糖蛋白与类风湿关节炎多药耐药及TNF-α水平的相关性研究目的：检测正常对照组、RA初发未治组、RA治疗有效组、RA难治组患者外周血单个核细胞P-gp表达和功能、TNF-αmRNA,血清’TNF-α水平,分析P-gp与RA多药耐药及TNF-α相关性,探讨P-gp、TNF-α在RA多药耐药中的作用及其相关性。方法：入选RA初治组、治疗有效组、难治组患者和正常对照组各20例为研究对象。RA初治组未经任何DMARDs及生物制剂治疗。RA治疗有效组和难治组以联合甲氨蝶呤、来氟米特为基础治疗药物,未经糖皮质激素和生物制剂治疗。入组RA患者进行疾病活动度评分(DAS28)。采集入组患者血标本进行血清和外周血单个核细胞的分离。以流式细胞仪检测外周血单个核细胞的P-gp的表达,罗丹明123蓄积试验检测外周血单个核细胞的P-gp的功能,RT-PCR检测外周血单个核细胞TNF-αmRNA水平,ELISA检测血清TNF-α浓度。结果：1.外周血单个核细胞P-gp的表达和功能：在正常对照组有P-gp表达,但表达量和功能低；RA初治组、RA治疗有效组及RA难治组P-gp表达和功能均高于正常对照；RA难治组P-gp的表达和功能较RA初治组、RA治疗有效组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；RA初治组P-gp的表达和功能高于RA治疗有效组(P<0.05)。2.外周血单个核细胞TNF-αmRNA和血清TNF-α水平：正常对照组TNF-αmRNA表达水平明显低于RA各组(P<0.01)。RA各组TNF-αmRNA表达水平两两比较,差异有统计学意义(P<0.01),其中RA难治组TNF-αmRNA表达水平最高,RA治疗有效组TNF-αmRNA表达水平最低。RA各组血清TNF-α含量较正常对照组高(P<0.01),其中RA难治组明显高于RA初治组和RA治疗有效组(P<0.01),RA初治组高于RA治疗有效组(P<0.01)。3.RA各组疾病活动的比较：RA初治组DAS28评分为5.70士1.46,明显高于RA治疗有效组(3.78±0.79,P<0.01)；RA难治组DAS28评分为7.02±0.93,明显高于其它两组(P<0.01)。4.PBMC P-gp的表达和功能与TNF-αmRNA、血清TNF-α水平和疾病活动度的相关性分析：PBMC P-gp的表达与PBMC TNF-αmRNA水平、血清TNF-α的水平均呈正相关(r=0.29,P<0.01；r=0.758,P<0.01)；罗丹明蓄积细胞内荧光强度与PBMC TNF-αmRNA.血清TNF-α的水平呈负相关(r=-0.843,P<0.01；r=-0.863,P<0.01)。PBMC P-gp的表达与DAS28做相关性分析,显示二者呈正相关(r=0.588,,P<0.01),罗丹明蓄积细胞内荧光强度与DAS28做相关性分析,显示二者呈负相关(r=-0.702,P<0.01)。5.PBMC P-gp的表达和功能与病程和用药时间的相关性分析：P-gp表达和功能与RA的病程和用药时间无明显关联。结论：1.RA难治组的PBMC P-gp表达和功能明显高于与RA初治组和RA治疗有效组,P-gp表达升高功能增强与RA的难治程度有关,P-gp参与难治性RA多药耐药的形成。2.RA治疗有效组P-gp表达和功能较RA初治组下降,且RA各组P-gp表达和功能与疾病活动评分DAS28呈正相关,提示P-gp可作为RA治疗效果的监测指标之一。3.P-gp表达和功能与RA的病程和用药时间无明显关联。4.P-gp表达和功能与PBMC TNF-αmRNA、血清TNF-α呈正相关,TNF-α可能参与P-gp介导的RRA多药耐药的形成。5.P-gp的表达和活性受原发耐药、继发耐药、疾病活动内环境改变等多重因素的影响。疾病活动内环境改变可能在RA P-gp的表达和活性增强中起着重要作用。第二部分TNF-α对RA外周血单个核细胞P-gp表达及活性的影响目的：观察TNF-α对RA外周血单个核细胞后P-gp表达及活性的影响,探讨TNF-α在RA MDR形成中的作用。方法：入选RA初治组、治疗有效组、难治组患者和正常对照组各20例为研究对象。采集入组患者血标本并进行外周血单个核细胞的分离,以终浓度0.5ng/ml的TNF-α作用于外周血单个核细胞,置于37℃C02培养箱中饱和湿度下培养,分别在TNF-α干预前和干预后2h、6h、12h、24h后,收集细胞,流式检测PBMC P-gp的表达,罗丹明123蓄积试验检测PBMC P-gp功能。结果：在TNF-α干预2h后,各组P-gp的表达与干预前无明显变化,但Rh123蓄积试验荧光强度下降,即P-gp的功能增强。干预12h各组的P-gp的表达和功能都能达到最大值并维持在高水平的平台上。干预12h与干预24h P-gp的表达和功能差异无统计学意义。在6h和12h的P-gp的检测中发现,各组在起效时间和达峰时间上不一致。在正常对照组干预6h,P-gp的表达较干预前升高(P<0.05),干预12h P-gp的表达达峰。在RA初治组,在干预6h,P-gp的表达较干预前升高(P<0.05),干预12h P-gp的表达达峰。在RA治疗有效组,干预12h,P-gp的表达才较干预前升高(P<0.01)并达到峰值。在RA难治组,干预6h P-gp的表达较干预前明显升高(P<0.01)并达峰。干预12h P-gp的表达和功能达峰,比较各组P-gp的表达和功能的情况,RA各组P-gp表达和功能高于正常对照组(P<0.01)；RA各组中难治组P-gp表达最高、功能最强,治疗有效组P-gp表达最低、功能最弱。结论：1.TNF-α可增强RA患者的PBMC P-gp的表达和功能,介导RA的多药耐药,参与难治性类风湿关节炎的产生。2.RA各组PBMC对相同浓度的TNF-α刺激上调P-gp的速度和效率不同,难治组起效和达峰所需时间短,治疗有效组起效和达峰所需时间长,这种差异性可能与细胞自身对TNF-α的内在反应性有关。3. TNF-α对各组PBMC P-gp的表达和功能的影响,在作用12h均可达到最大值,此后维持在高水平的平台上4.RA P-gp表达和活性增高的机制复杂,TNF-α的作用仅为影响P-gp的表达和活性增高的机制之一。第三部分TNF-α对RA外周血单个核细胞P-gp调控机制的研究目的：研究TNF-α信号转导途径中的MAPKs(ERK1/2、JNK和p38)及NF-κB信号转导途径在TNF-α增强RA PBMC P-gp表达和活性中的作用,探讨TNF-α对RA PBMC P-gp的调控机制。方法：入选RA初治组患者20例,采集入组患者血标本并进行外周血单个核细胞的分离。每份标本设6组：A组、B组、C组、D组、E组和F组。A组为空白对照组。在C、D、E、F组分别加入NF-κB、JNK、ERK1/2、p38的抑制剂PDTC、SP600125、U0126、SB202190进行预处理。处理30min后,B、C、D、E、F组均加入TNF-α,调整TNF-α终浓度为0.5ng/ml,置于37℃C02培养箱中饱和湿度下培养,12h后收集细胞,流式检测PBMC P-gp的表达,罗丹明蓄积试验检测PBMC P-gp功能。结果：与空白对照组相比,TNF-α组P-gp表达升高(P<0.01),Rh123荧光强度降低(P<0.01)即P-gp功能增强。用PDTC预处理抑制NF-κB活性或P600125预处理抑制JNK活性,与未预处理的TNF-α组相比,预处理组P-gp表达降低、功能减弱。用U0126预处理抑制ERK1/2活性或SB202190预处理抑制p38活性,与未预处理的TNF-α组相比,两组P-gp表达和功能差异无统计学意义结论：1. NF-κB的抑制剂PDTC和JNK抑制剂SP600125均可下调TNF-α诱导的RA PBMC P-gp的表达增加和功能增强。NF-κB和JNK信号转导通路介导TNF-a对RA PBMC P-gp的表达和功能的调控。2.ERK1/2抑制剂U0126和p38-MAPK抑制剂SB202190对TNF-α诱导的RA PBMC P-gp的表达增加和功能增强无影响。ERK1/2通路和p38-MAPK信号通路不直接参与TNF-α对RA PBMC P-gp的表达和功能的调控。3.TNF-α通过NF-κB和JNK信号转导通路的激活对RA PBMCP-gp的表达和功能进行调控。