第一部分3PO对脓毒症所致急性肺损伤的作用目的:研究3PO[3-(3-pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-Propen-1-One,PFKFB3同工酶的抑制剂]对脓毒症所致急性肺损伤的作用。方法:将C57BL/6实验鼠随机分成三组(每组10只鼠),分别是:control组(假手术组),CLP(Cecal Ligation and Puncture,盲肠结扎穿孔术)组、3PO+CLP组。Control组(假手术组):老鼠的盲肠行除外结扎与穿刺外(即跳过造模步骤6)的相同治疗并同样回纳到腹腔。CLP组(正常手术组):按照完整造模步骤执行。3PO+CLP组(加药组):在CLP术后0、6小时向小鼠腹腔注射50 u L含0.07 mg/g 3PO的DMSO(DiMethyl SulfOxide,二甲基亚砜)。记录每组CLP术后5天每12小时的小鼠生存情况,假手术组一同观察记录小鼠生存状态。5天后将所有实验小鼠安乐死,取小鼠肺组织行HE染色,评估肺损伤程度,测定肺湿干重比值,收集肺泡灌洗液检测炎症因子、炎症细胞渗出、乳酸水平,收集血液检测炎症因子。结果:1.脓毒症相关急性肺损伤模型的建立:小鼠盲肠结扎建立CLP模型后出现不同程度的精神萎靡、呼吸急促、寒颤、立毛、全身虚弱和行动能力减弱或丧失等典型脓毒症临床特征,24h后取肺组织进行HE染色,明确小鼠CLP模型是否成功。结果显示,假手术组肺组织结构清晰,上皮细胞排列整齐,肺泡腔干净?匀称,而CLP组肺组织结构破坏明显,充血、水肿、炎性细胞浸润。2.3PO对脓毒症小鼠肺部炎症的影响:Control组小鼠肺组织病理结果显示肺泡结构清晰完整,肺泡间隔正常,肺泡内及肺间质未见明显炎细胞浸润,间质内毛细血管无充血淤血表现;CLP组小鼠肺组织内可见肺泡扩张不均匀,肺泡壁普遍增厚,部分肺泡壁结构不清,毛细血管扩张淤血,肺间质部及肺泡腔内有较多的炎性细胞浸润,同时可见大量红细胞;CLP+3PO组小鼠经3PO处理后,肺组织病理损伤程度较CLP组明显较低,肺泡扩张较均勾,局部肺泡壁増厚,间质局部见少量炎细胞浸润。3.3PO对脓毒症小鼠肺水肿的影响:相Control组比较,CLP术后W/D(Wet to Dry ratio,湿干重比值)增加,差异有统计学意义(P<0.05,n=10)。与CLP组比较,3PO干预后W/D减少,差异有统计学意义(P<0.05,n=10)。4.3PO抑制脓毒症小鼠肺泡中炎症细胞的渗出及糖酵解的程度:相比于假手术组,CLP组的肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞数以及乳酸水平均有显著升高,P<0.01,n=10,差异有统计学意义;而腹腔注射3PO后,相对于CLP组,3PO+CLP组的肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞数以及乳酸水平均有改善,P<0.05,n=10,差异有统计学意义。这个结果提示我们3PO可以抑制脓毒症小鼠肺泡中炎症细胞的渗出及无氧酵解的程度。5.3PO可减轻脓毒症小鼠肺组织中的炎症反应:相比于假手术组,CLP组的肺泡灌洗液中TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-6(白细胞介素-6)、IL-1β(白细胞介素-1β)水平均有显著升高,P<0.01,n=10,差异有统计学意义;而腹腔注射3PO后,相对于CLP组,3PO+CLP组的肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β均有改善,P<0.05,n=10,差异有统计学意义。这个结果提示我们3PO可以抑制脓毒症小鼠肺泡中的炎症反应程度。6.3PO可减轻脓毒症小鼠全身炎症反应:与肺泡灌洗液中的趋势相同,相比于假手术组,CLP组的血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均有显著升高,P<0.01,n=10,差异有统计学意义;而腹腔注射3PO后,相对于CLP组,3PO+CLP组的血清中TNF-α、IL-6、IL-1β均有改善,P<0.05,n=10,差异有统计学意义。这个结果提示我们3PO可以不仅可以抑制脓毒症小鼠肺泡中的炎症反应程度,还可以抑制小鼠全身炎症反应程度。7.3PO改善脓毒症小鼠生存率:相较于假手术(Control)组,CLP组小鼠生存率显著下降(P<0.01);相较于CLP组,CLP+3PO组小鼠生存率提高(p<0.01)。结果提示3PO能够改善脓毒症小鼠的存活率。结论:本阶段实验通过成功建立小鼠的脓毒症模型,模拟了脓毒症相关急性肺损伤病理过程,导致小鼠肺损伤严重,生存率明显下降;3PO能够通过抑制肺组织病理变化,抑制肺泡中乳酸水平,减轻肺组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平,减轻全身炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平,减少肺组织中炎症细胞的渗出,保护肺组织细胞,提高小鼠生存率。我们的研究揭示3PO在促进炎症消退中的作用,并为治疗脓毒症诱导的急性肺损伤提供新的策略和治疗靶点。第二部分3PO抑制脓毒症相关的肺上皮细胞糖酵解和炎症因子产生目的:研究3PO对脓毒症相关肺上皮细胞糖酵解和炎症因子释放的影响。方法:将人肺上皮细胞A549细胞分为Control、LPS(脂多糖)、LPS+3PO三组培养,LPS组当细胞密度增至80%时用LPS(100ug/ml)在指定时间段(0、2、4小时)刺激A549细胞;LPS+3PO组在LPS刺激之前用3PO(20μmol/L)处理30min,然后用LPS(100ug/ml)在指定时间段(0、2、4小时)刺激A549细胞。给予LPS后24小时后,检测三组细胞培养基中的葡萄糖和乳酸,细胞裂解物中的LDH活性以及培养基中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平。结果:1.3PO可抑制LPS诱导的糖酵解:随着处理时间的增加,LPS组的葡萄糖消耗、乳酸脱氢酶(LDH)和乳酸的水平明显增加,而在相同时间点,LPS+3PO组的葡萄糖消耗、乳酸脱氢酶(LDH)和乳酸的水平明显被抑制,差异有统计学意义。2.3PO可抑制LPS诱导的细胞炎症因子释放:随着处理时间的增加,LPS组的TNF-α、IL-6、IL-1β三种炎症因子水平明显增加,而在相同时间点,LPS+3PO组的TNF-α、IL-6、IL-1β三种炎症因子水平明显被抑制,差异有统计学意义。结论:通过培养人肺上皮细胞A549,加入LPS模拟脓毒症环境,引起细胞外葡萄糖消耗和乳酸水平和细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性的显着增加,炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达显着增加;而经过3PO处理的细胞组糖酵解和炎性细胞因子释放相对LPS组有所减少。从细胞水平验证了3PO可以抑制脓毒症引起的的糖酵解和炎症细胞因子释放。第三部分3PO通过抑制细胞产生ROS减轻急性肺损伤细胞凋亡目的:探讨3PO对脓毒症相关肺上皮细胞凋亡影响及机制研究。方法:将A549细胞接种在六孔板上,分为Control、LPS、LPS+3PO、Lactate、Lactate+NAC、HCL、HCL+NAC七组,当细胞生长密度到80%时,LPS组用LPS(100μg/ml)在指定时间段(0、2、4小时)刺激A549细胞;LPS+3PO组在LPS刺激之前用3PO(20μmol/L)处理30min,然后用LPS(100μg/ml)在指定时间段(0、2、4小时)刺激A549细胞;Lactate组和HCL组直接用Lactate、HCL在指定时间段(0、2、4小时)刺激A549细胞,而Lactate+NAC组和HCL+NAC组在加Lactate和HCL前30分钟用NAC处理细胞,处理完毕后收集进行凋亡检测和活性氧测定。结果:1.3PO减少LPS诱导A549细胞ROS的产生:在LPS诱导的A549细胞中ROS产生显著升高,抑制糖酵解的3PO可以显著抑制LPS诱导的A549细胞中ROS产生;而用糖酵解产物Lactate也可以诱导的A549细胞中ROS产生;更为有趣的是用HCL降低培养基PH值同样可以诱导的A549细胞中ROS产生。结合前面的结果,提示LPS通过诱导A549细胞糖酵解,产生大量Lactate降低PH,进而诱导ROS产生。2.3PO减少LPS诱导的A549细胞凋亡:在LPS诱导的A549细胞中,预先使用氧化抑制剂NAC抑制ROS后,细胞凋亡减少。同时用3PO抑制糖酵解后,LPS诱导的A549细胞凋亡减少;糖酵解产物Lactate和HCL都可以增加A549细胞凋亡,其作用可以被NAC抑制。提示LPS通过促进A549细胞糖酵解,产生大量Lactate降低PH,进而增加ROS产生来诱导细胞凋亡;而3PO可以通过抑制糖酵解以及糖酵解产物的生成,降低ROS来减少细胞的凋亡。3.3PO抑制脓毒症小鼠肺泡细胞凋亡:与Control组相比,CLP组的凋亡比例明显升高,而CLP术后腹腔注射3PO组的凋亡比例明显改善,*P<0.05,n=10,差异有统计学意义。结论:LPS(100ug/ml)、乳酸(5mmol/L)和HCl对细胞凋亡的影响相似,且LPS和乳酸可引起ROS的显着增加,抗氧化剂NAC(10mmol/L)显著抑制由LPS和乳酸诱导的ROS的增加和细胞凋亡;经3PO处理后可以抑制LPS诱导的ROS增加和细胞凋亡。提示我们3PO通过抑制细胞产生ROS改善LPS诱导的细胞凋亡。