论文部分内容阅读
目的:本课题旨在探讨p38δ在宫颈癌组织细胞和Hela细胞系中蛋白表达水平的变化,及p38δ高表达对Hela细胞凋亡的影响,同时初步探讨p38δ在该调控过程中可能存在的分子机制,从而为宫颈癌的筛查、诊断及临床治疗提供新的思路。方法:1利用蛋白免疫印迹(western blot)法检测宫颈癌组织细胞及Hela细胞系中p38δ蛋白表达水平;2利用瞬时转染p38δ哺乳动物表达质粒,在Hela细胞中瞬时过表达p38δ;3利用Annexin V-FITC/PI双染色荧光显微镜观察法检测Hela细胞瞬时过表达p38δ后细胞凋亡水平的变化;4利用慢病毒转染及细胞耐药性筛选构建稳定表达p38δHela细胞株;5利用蛋白免疫印迹法和细胞免疫荧光染色法检测稳定表达p38δHela细胞株中p38δ的表达情况;6利用Annexin VFITC/PI双染色荧光显微镜观察法检测对照Hela细胞株和稳定表达p38δHela细胞株在缺氧条件(1%O2,24h)和顺铂处理条件(10ug/ml,24h)下细胞凋亡水平;7利用免疫沉淀(immunoprecipitation)法和蛋白免疫印迹法检测缺氧条件(1%O2,24h)和顺铂(10ug/ml,24h)处理条件下p38δ磷酸化水平;8利用瞬时转染野生型p38δ表达质粒和激酶失活突变体p38δ(K54R)表达质粒,以及Annexin V-FITC/PI双染色荧光显微镜观察法,检测野生型p38δ和激酶失活突变p38δ(K54R)对Hela细胞凋亡的影响;9采用蛋白免疫印迹法检测对照Hela细胞株和稳定表达p38δHela细胞株在缺氧条件(1%O2,24h)和顺铂处理条件(10ug/ml,24h)下,细胞中凋亡调控因子p53、Bcl-2及Bax的表达水平。结果:1与正常宫颈组织相比,宫颈癌组织中p38δ蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(p<0.05);与非癌性细胞系HEK293(human embryonic kidney 293)细胞、MEF(Mouse embryo fibroblast)细胞相比,宫颈癌细胞系Hela细胞中p38δ蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(p<0.05);2与转染空白对照载体Hela细胞相比,转染p38δ表达载体Hela细胞凋亡水平显著提高,差异有统计学意义(p<0.05);3与对照Hela细胞株相比,稳定表达p38δHela细胞株在缺氧条件及顺铂处理条件下细胞凋亡水平显著提高,差异均有统计学意义(p均<0.05);4与对照处理细胞相比,缺氧及顺铂处理后Hela细胞中p38δ第180位苏氨酸和第182位酪氨酸磷酸化水平显著提高,差异均有统计学意义(p均<0.05);5与转染野生型p38δ表达载体Hela细胞相比,转染p38δ激酶失活突变表达载体Hela细胞凋亡水平显著降低,差异有统计学意义(p<0.05);6与对照Hela细胞株相比,稳定表达p38δHela细胞株在缺氧及顺铂处理条件下,凋亡调控因子Bax和p53蛋白表达量显著上调,而Bcl-2蛋白表达量显著下调,差异均有统计学意义(p均<0.05)。结论:1在宫颈癌组织细胞和在宫颈癌Hela细胞中,p38δ的蛋白表达水平降低;2 Hela细胞中高表达p38δ促进细胞凋亡的发生,并且促进Hela细胞对低氧环境及顺铂的敏感度;3低氧环境及顺铂诱导p38δ活性的增加,并且p38δ对Hela细胞凋亡的调控依赖于其激酶活性;4 p38δ诱导在低氧环境和顺铂处理条件下Hela细胞中促凋亡因子p53、Bax的高表达和抗凋亡因子Bcl-2的低表达。